3’RACE 操作步骤及实验心得

一、试剂盒的选择：

3’RACE从原理上就能明白，它比5’RACE 要容易得多，所以并不一定需要用进口试剂盒。于是根据 Invitrogen GeneRacer Kit 自己DIY了，效果不错。找来了：Invitrogen的SuperScript III反转酶，TAKaRa　LA Taq酶、Pyrobest高保真酶。并根据 Invitrogen GeneRacer Kit，自己合成了3’接头引物：

3’接头：3'ap 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 -3'

54 bases

3’外侧：3'Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′ 25bases 76°C

3’内侧：3’Nested Primer 5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′ 23bases 72°C

二、体会与心得

1. RNA的质量：

RNA的质量对于3’RACE的成功至关重要， RNA的质量不好，其他全是白忙活。刚开始用了师兄半年前的RNA做不出来，后发现是由于RNA降解了，用新的RNA后问题就解决了。

所以提完了RNA后别怕麻烦，验证一下质量再往下做（看看OD260/280的值，再电泳检查一下），免得后面出了问题都没法找原因。

2. 引物质量：

引物的重要性也是在实验过程中慢慢体会到的，它往往是决定性的因素。刚开始为保险起见，我对应Invitrogen GeneRacer Kit提供的3’引物设计了内外两对引物(准备做巢式PCR，GSP1- 3’Primer and GSP2- 3’Nested Primer )，BTW：Invitrogen认为较高退火温度的引物特异性好一些。

刚开始按部就班的做，先用GSP1- 3’Primer去扩增 ，再用GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。也遇到了RACE常见的问题，3’-race第一轮PCR目的条带非常弱（没法回收），还伴有严重的smear。

这就要解决二个问题：① 减少非特异性扩增。 ② 增加目的片段的产量。当时，优化了一些PCR条件，试了Touch down PCR，也用第一轮PCR产物作模板用GSP1引物做二次PCR ，也用了GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。Touch down PCR、二次PCR的效果都不好。用巢式 PCR能得到目的片断，但效果也不怎么样。

后来，一次心血来潮直接用GSP2- 3’Nested Primer做第一轮PCR，直接就扩增到了效果较好的目的片段，后来用高保真酶扩增时也只需要一轮PCR 就可以了。由此可见，引物的质量是决定性的。一对好的引物，不需要很费事的去优化条件就能得到好的结果；而一对特异性不怎么好的引物，即使用很多方法去优化也很难得到理想的结果。

3. 扩增条件的优化：

影响PCR的因素很多,但我觉得这其中模板质量、引物质量、引物退火温度是最具决定性的因素。而诸如：模板浓度、引物浓度、热启动、酶量、延伸时间、PCR循环次数、是否Touch down PCR，这些都是锦上添花的因素。

也就是说，如果目的条带能扩增出来，优化一下条件能扩增得更好；但是如果目的条带压根就扩不出来，你在这些锦上添花的东西上花再多精力也没用，这时候就应该考虑在决定性因素上找找原因。