土井挞克树
我要对目的基因作pcr,凝胶回收目的片段之后和质粒连接,连接试剂盒用的是NEBuilder的,严格按照它的网上tool设计了四组目的基因和对应的质粒引物,其中所有质粒都能p出来且大小与预测一致,两组目的基因也没问题,问题出在另外两个基因,其中一个大小为2040bp的基因,跑胶显示条带大小很短,另一个1100bp的基因则是什么都没跑出来,我这两个基因都已经跑了3次了,2000多那个基因大小都是差不多这么小,请问是什么情况?
dxyc42u
引物特异性不好或者模板不纯都有可能
huarenqiang5
会不会是引物二聚体的带子?可以做个touchdown试试。
sswei
目的条带没p出来,可以重新设计引物或者做个退火温度的梯度。
loveliufudan
如果您在PCR反应中对目的基因进行了多次尝试,但其中一个2040bp基因的PCR产物显示很短的条带,另一个1100bp基因没有出现任何条带,可能存在以下几种情况:
1. 引物设计问题:请确保所使用的引物序列与目的基因序列完全匹配,并且引物之间没有任何互相补充配对。引物序列的选择和设计是PCR反应成功的重要因素。
2. PCR条件优化:尝试优化PCR反应条件,包括调整退火温度、延长延伸时间和优化引物浓度,以确保特定目的基因可以被有效扩增。
3. 目的基因的特殊性质:某些基因具有较高的GC含量、结构特异性或其他复杂性,可能需要特殊的PCR条件或方法来成功扩增。考虑使用特殊的缓冲液、酶或添加剂,如DMSO或betaine,以优化PCR反应。
4. 质粒与目的基因的相容性:确保所选择的质粒与目的基因相容,并且连接试剂盒的设计适用于您的目的。确保连接试剂盒中所使用的引物和酶可以正确地连接您的目的基因和质粒。
如果您已经尝试了多次PCR反应,而两个目的基因仍未成功扩增,建议检查和重新评估引物设计、PCR条件和连接试剂盒的使用方法。