求助加细菌处理的细胞划痕实验操作流程

1.先培养细胞到合适的细胞密度（80%左右）

2.培养细菌到有足够的菌数。

3.将细菌菌株制备成适当浓度(106-108 CFU/mL)的菌液，在细胞培养皿上滴加一定的菌液（含菌量可根据个人需求调整）。

4.细胞划痕：使用75％的酒精或70％的乙醇用棉球消毒细胞培养皿周围区域，然后使用细胞刮板在细胞层上沿着直线划出一个缺口（痕迹大小可根据个人需求调整）

5.检查细胞和菌液：将培养皿放回CO2孵化器中，观察细胞和菌液的相互作用情况。

6.定时取样：在细胞和菌液相互作用24小时后，使用显微镜检查划痕区域内的细胞形态变化情况，或者将细胞收集下来进行Western blot或其他分析。

以下是一个基本的细胞划痕实验操作流程，用于研究细菌对细胞迁移和创伤修复的影响：

1. 准备实验材料和试剂：

- 细胞培养物：选择适当的细胞系，如培养的上皮细胞或成纤维细胞。

- 细菌培养物：选择适当的细菌株，如大肠杆菌（Escherichia coli）。

- 细胞培养基：根据细胞类型选择适当的培养基，并添加所需的补充物。

- 培养皿：使用无菌培养皿，如培养皿或多孔板。

- 显微镜：用于观察细胞划痕和迁移的显微镜。

2. 细胞培养和预处理：

- 将细胞解冻或传代到适当的培养皿中，根据实验要求使其达到合适的密度。

- 在细胞培养前处理细胞，例如使其静置或进行低血清处理，以减少细胞增殖速率和创伤修复。

- 检查细胞的健康状况和适应培养基，确保细胞在实验开始前具有正常的形态和生长。

3. 划痕制备：

- 在细胞培养皿中使用无菌的P200移液器尖端或细胞划痕器，在细胞单层中划出一道直线或几道划痕。

- 划痕的宽度和长度可以根据实验要求进行调整。

4. 细菌感染和处理：

- 从细菌培养物中取一定量的细菌悬浮液，向划痕区域加入适量的细菌。注意，应该在无菌条件下进行操作。

- 控制实验条件，例如细菌浓度和感染时间，以满足实验要求。

5. 实验处理组设置：

- 设置对照组：在划痕区域中加入无菌培养基，作为未感染细菌的对照组。

- 设置其他实验处理组，如使用不同浓度的抗生素或添加其他生物活性物质。

6. 培养细胞：

- 将细胞培养皿放入恒温培养箱中，保持适当的温

度和气氛条件（通常为37°C和5% CO2）。

- 培养一定时间，以允许细菌感染和细胞迁移。

7. 细胞划痕观察和分析：

- 使用显微镜观察划痕区域，并记录细胞迁移的情况。可以使用相位对比或荧光显微镜进行观察。

- 通过拍摄图像或录像来记录细胞划痕实验的结果。

- 使用图像处理软件或细胞分析工具来定量分析细胞迁移的程度和速度。

以上是一个一般的细胞划痕实验操作流程，具体的实验步骤和条件可能因实验设计、细胞类型和研究目的的不同而有所差异。在进行实验前，请确保遵循适当的实验室操作规范和无菌技术，以确保实验的准确性和可靠性。

一、实验前准备

实验开始前，将离心管、吸管筒、移液枪、枪头，直尺等放入无菌超净工作台，以紫外 线照射 30min。然后，采用通风机通风 3min。 取出无菌 6 孔板，用黑色记号笔在 6 孔板底部，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5~1cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 3 条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察 点，这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点，最终可以获得多个数据。 画好横线后，在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜，且将每个试剂瓶和离心管拧松，方便后续试验的操作。

二、细胞准备

取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌 PBS 清洗细胞。加入 1ml 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收 集细胞悬液于 15ml 离心管中，800rpm/min 室温离心 5min。用罗氏 CASY 快速细胞计数及 活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。，以每孔 1~4×105 细胞的密度 接种到 6 孔培养板上，在含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中培养一天。具体数量因细胞种 类不同而不同，掌握为过夜能铺满。

三、直线划痕

取出铺满六孔板的细胞，用 200ul 枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂 直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈 #字形划痕。

四、PBS 清洗细胞及培养

吸掉旧培养基，用无菌 PBS 洗细胞表面 3 次，去除划下的细胞，加入含有 1%胎牛血清 的培养基为阴性对照，及含有相应浓度药物的 1%胎牛血清培养基为药物刺激组；每组 2 个 复孔。 轻轻摇动六孔板，使药物与细胞培养液充分混合，放入 37 度，5%C02 培养箱中培养。

五、结果观察

分别取划痕 0 小时、24hr、48hr 后观察不同处理组的痕道宽度。 结果可见：细胞划痕后 48h 观察到对照组细胞划痕宽度恢复约 90％，而药物抑制组恢 复约 60％。 表明加入药物后，由于药物的作用，使细胞迁移受到抑制，而未加入药物的细胞保持原 有的迁移能力，在 48h 后通过迁移将划痕掩盖。