晴空a
用12ml无Ca2+Tyrode液冲洗腹腔,轻揉3min后,提取腹腔冲洗液,离心并弃去上清液,0.75ml无Ca2+Tyrode液重悬细胞后,并与3.5ml的1.110g/ml的percoll液混合,经130g,15min离心后,弃去最上面的2.5ml的悬液,所得的细胞即为肥大细胞。
loveliufudan
以下是一种常用的小鼠腹腔肥大细胞的分离提取方法:
材料和试剂:
小鼠(建议使用BALB/c小鼠)
PBS(含有1% BSA和0.1% EDTA)
DMEM/F12培养基
1% 溶血液(含有10 mM KCl,0.1 mM KH2PO4,1.5 mM MgCl2和10 mM Tris-HCl,pH 7.5)
0.25% 胰蛋白酶(含有2 mM EDTA)
5% CO2孵育箱
步骤:
使用无菌工具,将小鼠处死,用70%乙醇消毒小鼠腹部皮肤表面。
用无菌器具将腹腔部位暴露并消毒,用无菌注射器将PBS缓冲液注入腹腔,缓慢注入以避免损伤内脏。
用无菌剪刀和镊子将腹腔剖开,将腹腔肥大组织取出并置于含有PBS的培养皿中,用剪刀切成小块。
将组织块转移到一个50 mL离心管中,加入10 mL的1% 溶血液和轻轻摇动管子。
将组织悬浮液放入37°C的水浴中,孵育15分钟使红细胞溶解。
离心10分钟(800×g,4°C),倒掉上清液。
加入5 mL DMEM/F12培养基,用200 μL的移液器吸取混合液,加入1 mL 0.25%胰蛋白酶中,孵育10分钟,轻轻摇动混合液,使细胞分散。
加入10 mL DMEM/F12培养基,用过滤网过滤细胞悬浮液以去除残留的组织碎片。
离心10分钟(800×g,4°C),倒掉上清液。
加入10 mL DMEM/F12培养基,将混合液转移至含有10% 胎牛血清的培养皿中,培养4-6小时,使腹腔肥大细胞附着于培养皿底部,去除培养皿中的非附着细胞和培养基,加入新的DMEM/F12培养基和10% 胎牛血清,继续培养,通常在37℃,5% CO2的条件下进行。每2-3天更换一次培养基,直至细胞生长至足够密集。在培养细胞时,应注意细胞的状态、密度和生长速度,避免细胞超过对数生长期和细胞寿命的极限。
毛利小五郎的徒弟
可以采用Percoll梯度分离法对小鼠腹腔肥大细胞进行分离