求助，人脐带间充质干细胞的提取方法，酶解法好几次了都不成功

1.制备:使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。静置培养7天。第8天根据生长情况，进行换液、传代。

2.换液:根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。

​3.传代:每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液(2%FBS+aMEM)10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。1200rpm，离心6min，弃上清。合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网、计数。根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2x104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

​4.收获:每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。加生理盐水至40ml，取500ul上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。冻存细胞数应控制在2~5x10 /ml范围内。利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。

人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的提取方法有很多种，其中常用的方法包括酶解法、机械法和化学法等。

如果您使用酶解法提取UC-MSCs不成功，可能需要重新审视您的实验流程。以下是一些可能导致实验不成功的原因及解决方案：

酶的种类、质量和浓度不合适：目前常用的UC-MSCs酶有胶原酶、胰酶、玉米粉等，应根据实验需要选择合适的酶种类、质量和浓度，例如胶原酶的浓度在0.1%到0.5%之间较为适宜，胰酶的质量和浓度也要根据不同实验需求进行调整。

酶解时间和温度不合适：酶解时间和温度也是影响提取效果的重要因素，一般酶解时间为4-24小时，温度在37°C下进行，过短或过长的酶解时间以及过高或过低的温度都会影响细胞的活性和提取效果。

操作不规范：提取UC-MSCs需要严格按照实验流程操作，包括脐带清洗、酶解、筛选、培养等步骤，若操作不规范也会影响实验结果。

杂菌或细胞污染：杂菌或细胞污染也可能导致提取效果不好，因此应注意实验器材的消毒、培养条件的控制等。

1、经孕妇同意后，在手术台上取下足月新生儿的脐带，浸泡在PBS中常温保存。2、取出浸泡过PBS的脐带，切成2cm的片段。3、用PBS将脐带洗净，剪掉动脉以及静脉。4、再次洗净，将脐带剪成2mm大小。5、将组织块贴间隔5mm贴在6孔板上，在上面滴上专用培养基。6、放置37°细胞培养箱中4小时后取出。7、再次滴上培养基，放入培养箱，7天左右可提取出培养细胞