原理
运用消化法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的培养，并用倒置显微镜进行形态学观察和用免疫组化对培养细胞进行鉴定。
材料与仪器
脐带
胶原酶消化液 胰蛋白酶 胶原酶 弹性蛋白酶 DMEM
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱
胶原酶消化液 胰蛋白酶 胶原酶 弹性蛋白酶 DMEM
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱
步骤
一、实验步骤
1. 冰冷无菌D-Hanks'液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks'液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片。
1. 冰冷无菌D-Hanks'液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks'液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片。
2. 用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks'液反复清洗8~10 次。
3. 加入 10 倍体积无菌胶原酶消化液(1 mg/mL)，室温消化30 min，1000 rpm离心 5 min，弃上清，加1 mg/mL胰蛋白酶 37℃消化 20 min，再次离心5 min，弃上清。
4. 加入胰蛋白酶 37℃消化20 min，再次离心5 min，弃上清。
5. 加胶原酶(1 mg/mL)弹性蛋白酶(0.5 mg/mL) 混合消化液 37℃消化 20 min，再离心5 min，弃消化液。
6. 加混合消化液 37℃消化 20 min，再次离心 5 min，细胞加含 10% FBS的DMEM培养基重悬，转入培养皿 37℃、5% CO2培养箱中培养即可。
注意事项
1. 必须要在无菌的环境下取材，取材后脐动脉立即置入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的D-hank's液中。
2. 血管从离体到原代培养的细胞时间尽量要短，以保证细胞能在最快的时间内获得营养。
3. 细胞培养液的PH在7.2-7.4，宁酸勿碱。因为胎儿脐动脉血管平滑肌细胞对碱性条件下耐受性较差。
4. 在原代培养初期，培养液的含量在3ML以下，最适宜的为1-1.5ML，仅够保持植块湿润即可。
常见问题
1. 稀疏排列的单层细胞处甚至无细胞处，这是平滑肌细胞的特征生长表现。
2. 人动脉血管平滑肌细胞体外培养要求高，细胞经过数次传代可发生细胞凋亡和退化，造成体外培养成功率很低，运用贴壁法可进行胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养。
参考：姜黔峰 ，商黔惠 ，巩亮 ，等.人脐动脉平滑肌细胞培养方法的探讨，遵义医学院学报，2005 , 28 (2) :118-119
来源：丁香实验
