【求助】质粒构建不成功，课题无进展，请求帮助

我在做hBrf1这个基因，目前是要构建4个质粒。

步骤：

1、PCR引物设计，加酶切位点，扩增产物2982+56bp，跑胶鉴定。

2、PCR产物跑胶，回收，phenol,chloroform,NaAc+Ethanol提纯。老板说如果测浓度太浪费sample

3、双酶切，体系100ul,两个酶分别为2ul。双酶切之后提纯。（已经双酶切PGL3-basic，酶切过的在LB平板上长出3个克隆，没有酶切过的载体则是一片一片的克隆，说明两个酶均有活性。）

4、与双酶切过的PGL3-basic进行连接。16°过夜。因为ligase在温度高时容易失活，操作在冰上进行。然后放入PCR仪中，16°过夜。

5、转化

6、铺LB（AMP+）平板，只长出一个克隆。质粒提取后鉴定 结果仍为没有酶切成功的PGL3-BASIC.

请问成功构建质粒的朋友们，我的问题出在哪里？

1、是不是质粒和vector的比例还是应该在3:1左右，应该测浓度？

2、老板让我做过很多次这个实验了，他让我加0.5ul,1ul,2ul,4ul的双酶切后的载体，已经形成梯度了。

3、另外我的PCR产物回收后用2ul跑胶，条带不是很亮，跟marker差不多，我一共是20ul ddH2O溶解PCR产物，也就是说最后的量顶多在2ug左右，双酶切之后又提纯，可能又丢失了一些，是不是PCR产物量不够导致的失败？

谢谢各位，目前实验处于瓶颈期，请求大家的帮助。

PCR产物酶切后做克隆难度较大，可能与酶切后目的基因的量有关，而且你的片段相对大；

我的建议是：将纯化的PCR产物先与T载体相连构建T_A克隆（一般的Taq酶PCR扩增后两端会形成A），然后鉴定T载体中目的基因是否正确；若插入正确，培养细菌提取重组的T克隆进行酶切得到目的基因，然后再与相应的酶切质粒连接。另外目的基因与质粒的比例3:1~10:1，目的基因的量应该大些。

祝好运！

我不明白为什么不用柱纯化，经济有快。
问一下，你的pcr引物保护碱基设了几个？

多做点16度连接后，跑个胶看下能不能连的上

我猜楼主应该是在做hBrf1这个基因的启动子报告基因了，用PCR扩增不同长度的启动子片段，然后克隆到PGL3 basic载体上，继续进行下游的双荧光酶报告基因实验了。想当年我的第一次克隆也是构建这样的截断性载体，前后花了好几个月，被老板批了N次，最后还是老板亲自动手演示了一遍，学到正宗的克隆技术，才得以成功。关于你的这个克隆，我的意见如下：
1）选用好一点的聚合酶，保证序列的保真性。我们一直使用一种叫做KAPA HIFI READYMIX的酶，很方便，扩增能力和保真度都超级好。普通的taq酶扩增长片段容易出错，反而浪费时间和试剂。
2） 如果直接酶切PCR产物，请确保你的上下游引物5'端已经引入合适的酶切位点和保护碱基（非常重要），我当时选用的是XhoI和HindIII这两个位点。
3）凡是用来做克隆的DNA产物，跑胶一定要用新鲜的TAE buffer，染EB也要用双蒸水EB溶液，避免污染。
4）最后做连接之前，把insert和vector各取2ul跑胶，看一下条带的亮度和size，如果都没有问题，可以进行连接反应。关于连接反应，我用的是NEB的T4 Ligase系统，我喜欢一个克隆设置3个反应，即insert分别为0ul，1ul和2ul。vector均为2ul，总体系10ul，室温下放置24小时候转化（老板说只要4个小时就可以转化，但是我没有试过），过夜孵育后观察克隆形成情况，快速胶检，一般都会得到阳性克隆。

如果PCR直接酶切实在不work的话，那就上TA吧，再从TA上cut下来，应该行的。

祝好运。

谢谢各位的回帖。保护碱基一共是6个。纯化柱我也想用，但是老板说用胶回收很好，不给买。楼上的猜的非常准确，我就是要做这个实验，但是目前质粒都构建不出来，着急上火。

老板之前总批我，现在连批都懒得批了。

我用的是高保真的酶，PCR产物跑胶也在3000bp的位置 。

你是说室温放置24小时连接？不是24小时转化吧？

TA我还没试过，我跟老板谈谈。

十分感谢。

我说的是连接体系置于室温，24小时后做转化。

24小时的室温连接，我也做过了，还是没有成功。所以我在查找原因，继续盲目的做，只会浪费时间和试剂，老板的脸拉的老长老长的。

我打算自己买胶回收试剂盒，让我同学帮忙，邮寄到洛杉矶。

请问各位，哪个公司的胶回收试剂盒好用一些？

碧云天的还是TAKARA的好用？我在网上搜的目前是这两种。

PCR产物酶切后做克隆很容易

大片段3000bp的也很容易做

总结教训，你直接拿PCR产物测序，看扩到目的基因了吗，找到了自己要的基因再连接不迟。

保护碱基为什么假保护碱基加6个干什么？

我做了几十个过表达了

从来只加2个

takara的高保真酶很好也很便宜

p 3k的很好p





另外 很多质粒连不好 多半是双酶切切得不好

请严格按NEB双酶切要求，如果用neb酶的话

另外 NEB说不能同时双酶切的

务必两个单酶切



酶切切得好 没有理由构不出

顶楼上，如果两个酶切位点相差很少，例如只有几个bp，双酶切是切不好的，即使用跑胶来鉴定，也鉴定不出来，最可靠的就是采用单酶切的方法切两次，建议试试。

给你几点建议：

1.pcr产物做TA克隆，再酶切下来继续做下面的克隆，这样你的目的片段的量多可以保证你多次重复实验使用，一举两得；

2.建议你的载体取少量分别做单酶切，这样可以鉴定是否两个酶都可以切开；

3.你的载体双酶切后建议你做个载体的自连对照，和连入目的片段的同时转化，这样可以排除长出的克隆是不是你的载体自连；

测序了，Forward测出来的没问题，Reverse测出来的不行。老板说不测序，继续往下做。
Reverse primer是他设计的，而且要求不能换。（我已经回国了，那个课题我没再继续做了，因为我感觉我做不出来，我就跑了。呵呵。）

1.你用neb 的t4 室温（有空调）30min以上 排除连接问题
2.载体双酶切你必须保证 两个酶是否能同时用 不能的话 你有没有分开切
3.pcr产物酶切后回收