请求大家帮助！RT-PCR引物设计
丁香园论坛
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各位好！我是分子生物学实验的新手。我的课题的第一步是要用RT-PCR获得全长的cDNA（接到pMD-18上）,我用如下引物的话是不是无法得到所要的目的序列？因为primer5.0的评分很差的。各位好朋友能否帮帮我？
Genebank Accession Number :AF144325
gene:1...1758
cds: 100....1731
1 aggagaaaag ggcgctgggg ctcggcggga ggaagtgcta gagctctcga ctctccgctg
61 cgcggcagct ggcgggggga gcagccaggt gagcccaaga tgctgctgcg ctcgaagcct
121 gcgctgccgc cgccgctgat gctgctgctc ctggggccgc tgggtcccct ctcccctggc
181 gccctgcccc gacctgcgca agcacaggac gtcgtggacc tggacttctt cacccaggag
241 ccgctgcacc tggtgagccc ctcgttcctg tccgtcacca ttgacgccaa cctggccacg
301 gacccgcggt tcctcatcct cctgggttct ccaaagcttc gtaccttggc cagaggcttg
361 tctcctgcgt acctgaggtt tggtggcacc aagacagact tcctaatttt cgatcccaag
421 aaggaatcaa cctttgaaga gagaagttac tggcaatctc aagtcaacca ggatatttgc
481 aaatatggat ccatccctcc tgatgtggag gagaagttac ggttggaatg gccctaccag
541 gagcaattgc tactccgaga acactaccag aaaaagttca agaacagcac ctactcaaga
601 agctctgtag atgtgctata cacttttgca aactgctcag gactggactt gatctttggc
661 ctaaatgcgt tattaagaac agcagatttg cagtggaaca gttctaatgc tcagttgctc
721 ctggactact gctcttccaa ggggtataac atttcttggg aactaggcaa tgaacctaac
781 agtttcctta agaaggctga tattttcatc aatgggtcgc agttaggaga agattttatt
841 caattgcata aacttctaag aaagtccacc ttcaaaaatg caaaactcta tggtcctgat
901 gttggtcagc ctcgaagaaa gacggctaag atgctgaaga gcttcctgaa ggctggtgga
961 gaagtgattg attcagttac atggcatcac tactatttga atggacggac tgctaccagg
1021 gaagattttc taaaccctga tgtattggac atttttattt catctgtgca aaaagttttc
1081 caggtggttg agagcaccag gcctggcaag aaggtctggt taggagaaac aagctctgca
1141 tatggaggcg gagcgccctt gctatccgac acctttgcag ctggctttat gtggctggat
1201 aaattgggcc tgtcagcccg aatgggaata gaagtggtga tgaggcaagt attctttgga
1261 gcaggaaact accatttagt ggatgaaaac ttcgatcctt tacctgatta ttggctatct
1321 cttctgttca agaaattggt gggcaccaag gtgttaatgg caagcgtgca aggttcaaag
1381 agaaggaagc ttcgagtata ccttcattgc acaaacactg acaatccaag gtataaagaa
1441 ggagatttaa ctctgtatgc cataaacctc cataacgtca ccaagtactt gcggttaccc
1501 tatccttttt ctaacaagca agtggataaa taccttctaa gacctttggg acctcatgga
1561 ttactttcca aatctgtcca actcaatggt ctaactctaa agatggtgga tgatcaaacc
1621 ttgccacctt taatggaaaa acctctccgg ccaggaagtt cactgggctt gccagctttc
1681 tcatatagtt tttttgtgat aagaaatgcc aaagttgctg cttgcatctg aaaataaaat
1741 atactagtcc tgacactg
上游：5－GC GAA TTC ATG CTG CTG CGC TCG AAG CCT－3(加入EcoRⅠ切点含起始密码)
下游：5－GG AAG CTT TCA GAT GCA AGC AGC AAG TTT－3(加入HindⅢ切点含终止密码)
还有一个问题：如果在引物合理的前提下，用invitrogen的SuperscriptTM一步法反转录PCR系统
容易得到1650bp左右的片段吗？
Genebank Accession Number :AF144325
gene:1...1758
cds: 100....1731
1 aggagaaaag ggcgctgggg ctcggcggga ggaagtgcta gagctctcga ctctccgctg
61 cgcggcagct ggcgggggga gcagccaggt gagcccaaga tgctgctgcg ctcgaagcct
121 gcgctgccgc cgccgctgat gctgctgctc ctggggccgc tgggtcccct ctcccctggc
181 gccctgcccc gacctgcgca agcacaggac gtcgtggacc tggacttctt cacccaggag
241 ccgctgcacc tggtgagccc ctcgttcctg tccgtcacca ttgacgccaa cctggccacg
301 gacccgcggt tcctcatcct cctgggttct ccaaagcttc gtaccttggc cagaggcttg
361 tctcctgcgt acctgaggtt tggtggcacc aagacagact tcctaatttt cgatcccaag
421 aaggaatcaa cctttgaaga gagaagttac tggcaatctc aagtcaacca ggatatttgc
481 aaatatggat ccatccctcc tgatgtggag gagaagttac ggttggaatg gccctaccag
541 gagcaattgc tactccgaga acactaccag aaaaagttca agaacagcac ctactcaaga
601 agctctgtag atgtgctata cacttttgca aactgctcag gactggactt gatctttggc
661 ctaaatgcgt tattaagaac agcagatttg cagtggaaca gttctaatgc tcagttgctc
721 ctggactact gctcttccaa ggggtataac atttcttggg aactaggcaa tgaacctaac
781 agtttcctta agaaggctga tattttcatc aatgggtcgc agttaggaga agattttatt
841 caattgcata aacttctaag aaagtccacc ttcaaaaatg caaaactcta tggtcctgat
901 gttggtcagc ctcgaagaaa gacggctaag atgctgaaga gcttcctgaa ggctggtgga
961 gaagtgattg attcagttac atggcatcac tactatttga atggacggac tgctaccagg
1021 gaagattttc taaaccctga tgtattggac atttttattt catctgtgca aaaagttttc
1081 caggtggttg agagcaccag gcctggcaag aaggtctggt taggagaaac aagctctgca
1141 tatggaggcg gagcgccctt gctatccgac acctttgcag ctggctttat gtggctggat
1201 aaattgggcc tgtcagcccg aatgggaata gaagtggtga tgaggcaagt attctttgga
1261 gcaggaaact accatttagt ggatgaaaac ttcgatcctt tacctgatta ttggctatct
1321 cttctgttca agaaattggt gggcaccaag gtgttaatgg caagcgtgca aggttcaaag
1381 agaaggaagc ttcgagtata ccttcattgc acaaacactg acaatccaag gtataaagaa
1441 ggagatttaa ctctgtatgc cataaacctc cataacgtca ccaagtactt gcggttaccc
1501 tatccttttt ctaacaagca agtggataaa taccttctaa gacctttggg acctcatgga
1561 ttactttcca aatctgtcca actcaatggt ctaactctaa agatggtgga tgatcaaacc
1621 ttgccacctt taatggaaaa acctctccgg ccaggaagtt cactgggctt gccagctttc
1681 tcatatagtt tttttgtgat aagaaatgcc aaagttgctg cttgcatctg aaaataaaat
1741 atactagtcc tgacactg
上游：5－GC GAA TTC ATG CTG CTG CGC TCG AAG CCT－3(加入EcoRⅠ切点含起始密码)
下游：5－GG AAG CTT TCA GAT GCA AGC AGC AAG TTT－3(加入HindⅢ切点含终止密码)
还有一个问题：如果在引物合理的前提下，用invitrogen的SuperscriptTM一步法反转录PCR系统
容易得到1650bp左右的片段吗？
