RT-PCR新手上路急盼园主等前辈帮助!!!!

我是一名新手，最近准备做一项RT-PCR检测小鼠脾组织含某种病毒的工作，刚接

触分子生物学，在丁香园上看了诸多帖子，感觉是受益非多。但由于没有实践，

很多东西仅停留在感性认识，有些还不怎么懂，希望得到前辈的帮助。
1.脾组织的磨碎：我询问并参观了学校的有关老师的做法：在用Triol提的时候

，是把脾组织称取50mg放入1.5ml离心管内，加入提取液后，然后用眼科剪剪碎

，之后用手拿离心管按在磁力涡旋混匀器打悬，由于剪刀一下很难剪碎，所以反

复多次用剪刀剪。感觉很费时[约2-4小时]，而且由于样本多时，剪刀很容易混

合交叉污染。询问是否可用研磨器，答之倒来倒去怕影响定量。我的实验因为是

药理实验，可能动物标本比较多，如果这样处理，实在是很费时，不知前辈们有

什么好办法？看了大家的经验，说可以用匀浆的。不知是什么匀浆器。我们这里

条件简陋，只有研药用的研钵以及手动的玻璃组织研磨器，不知可不可以用。组

织研磨器研磨组织时一些组织会磨不碎，是否可用，如果这些可以用，一般用时

先期应该怎样处理。
2.RT-PCR听说做内参才算可靠。听说分竞争性内参和菲竞争性内参，它们的优缺

点是什么？适合怎样的场合。选择肌动蛋白之类的内参是否根据模板的不同，每

个人选择的和设计的序列也不同？。为什么内参加入后能起到半定量的作用？，

是否内参应与模板一段序列有相同？。
内参是加在同一管中的吗？那酶与其他反应物的量与没加内参时是否要加倍，应

该怎样变化的？
我的实验是用病毒攻击小鼠，然后用药，最后用RT-PCR检测各组鼠脾的病毒，相

互比较药物抑制病毒的效果，如果每组抽着做2-3只鼠脾PCR，检测出来的数据根

本没法说明问题，如果用PCR定量检测每只动物的脾病毒量，半定量的RT-PCR能

否做到这一点吗？不知有没有经济而可靠的方法？
3、PCR产物跑胶后的图没有相关的专业分析软件，不知有没有方便的软件可以计

算灰度之类的，到哪可下载一个？
4、由于初次接触RT-PCR，很多东西不知具体应该怎么做。不知前辈有没有自己

成熟工作成果，能结合一个具体的研究实例，从如何引物设计，到内参的设计与

加入，到最后PCR产物凝胶图象的分析等有理论有实践的文章，如果有的话能寄

给我一份，将使我终身受益，不啻是黑暗中的引路人，不胜感激！！！我的邮箱

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