各位前辈：看看我的RT-PCR方案是否可行？？
丁香园
1362
我要扩增一种逆转录病毒（)的某段基因。将这段基因用RT-PCR方法扩出来后，再用pcDNA3.1转到Hela细胞中，观察它对细胞一些表达产物具有正向还是负相的调节作用。基因序列如下：
1 atggaacaag ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc cacacaatga atggacacta
61 gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcctaggat ttggctccat
121 ggcttagggc aacatatcta tgaaacttat ggggatactt gggcaggagt ggaagccata
181 ataagaattc tgcaacaact gctgtttatc cattttcaga attgggtgtc gacatagcag
241 aataggcgtt actcgacaga ggagagcaag aaatggagcc agtagatcct ag
（292bp）
设计的引物是5’atggaacaag ccccagaaga ccaagg...................
5’-cgg||gatcc atggaacaag ccccagaaga c-3’（left primer,29bp）
... aaatggagcc agtagatcct ag 3’
3’ctagga tc tgatctcggg a cctag||ggc 5’
(right primer，27bp)
（其中cg为引物的保护性基因，|| pcDNA 的BamHI的酶切位点，cctagg为BamHI发挥特异性酶切的片断）
我对RT-PCR毫无经验，来丁香园看收获颇多，高手也很多。因而想请教如下问题：
1，我看到有站友说内参,请问在这个实验中，要不要设内参？若要，具体怎样操作？我已向上海生工定了如上引物，内参是由生工自己合成后与引物一起送过来？还是要自己作内参？
2，我们同时作该逆转录病毒的临床检测FQ-PCR，用的是一整套试剂盒，但该试剂盒只扩增该病毒的另一种基因，我想问，该试剂盒提取总的RNA时所用的裂解液是否可用于我这个实验中？另外，该试剂盒说明书是从新鲜抗凝血离心后去其上血清来提取总RNA的，我是否也应从血清中提取？
3，扩增出cDNA后，那我如何算它的量？怎样知道PCR后到底有多少该种产物？
4，一个老问题：是一步法好呢还是二步法？我与别人分一个试剂盒，请问怎样才能分得好或公平一些？要在怎样的条件下操作？定的是Sigma的，不知各位高手觉得该公司的怎么样？我看园里有人推荐大连宝生物的，效果到底怎样？我的宝丝是既要花钱少，又要出成果的人，大家能不能给推荐一个购买试剂的方案以符合他的要求？
5，另外 RT Reagents (for TaKaRa Real Time RT-PCR Core Kit)
PCR Reagents (for TaKaRa Real Time RT-PCR Core Kit)
TaKaRa Real Time One Step RNA PCR Kit
第一二是不是将RT与PCR分开的两步法试剂盒，第三是一步法的试剂盒？
6，我做RT-PCR只是万里长征的一步，大家对我其后的（RT-PCR后）的有甚么好建逸？？
希望多多指教啊
1 atggaacaag ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc cacacaatga atggacacta
61 gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcctaggat ttggctccat
121 ggcttagggc aacatatcta tgaaacttat ggggatactt gggcaggagt ggaagccata
181 ataagaattc tgcaacaact gctgtttatc cattttcaga attgggtgtc gacatagcag
241 aataggcgtt actcgacaga ggagagcaag aaatggagcc agtagatcct ag
（292bp）
设计的引物是5’atggaacaag ccccagaaga ccaagg...................
5’-cgg||gatcc atggaacaag ccccagaaga c-3’（left primer,29bp）
... aaatggagcc agtagatcct ag 3’
3’ctagga tc tgatctcggg a cctag||ggc 5’
(right primer，27bp)
（其中cg为引物的保护性基因，|| pcDNA 的BamHI的酶切位点，cctagg为BamHI发挥特异性酶切的片断）
我对RT-PCR毫无经验，来丁香园看收获颇多，高手也很多。因而想请教如下问题：
1，我看到有站友说内参,请问在这个实验中，要不要设内参？若要，具体怎样操作？我已向上海生工定了如上引物，内参是由生工自己合成后与引物一起送过来？还是要自己作内参？
2，我们同时作该逆转录病毒的临床检测FQ-PCR，用的是一整套试剂盒，但该试剂盒只扩增该病毒的另一种基因，我想问，该试剂盒提取总的RNA时所用的裂解液是否可用于我这个实验中？另外，该试剂盒说明书是从新鲜抗凝血离心后去其上血清来提取总RNA的，我是否也应从血清中提取？
3，扩增出cDNA后，那我如何算它的量？怎样知道PCR后到底有多少该种产物？
4，一个老问题：是一步法好呢还是二步法？我与别人分一个试剂盒，请问怎样才能分得好或公平一些？要在怎样的条件下操作？定的是Sigma的，不知各位高手觉得该公司的怎么样？我看园里有人推荐大连宝生物的，效果到底怎样？我的宝丝是既要花钱少，又要出成果的人，大家能不能给推荐一个购买试剂的方案以符合他的要求？
5，另外 RT Reagents (for TaKaRa Real Time RT-PCR Core Kit)
PCR Reagents (for TaKaRa Real Time RT-PCR Core Kit)
TaKaRa Real Time One Step RNA PCR Kit
第一二是不是将RT与PCR分开的两步法试剂盒，第三是一步法的试剂盒？
6，我做RT-PCR只是万里长征的一步，大家对我其后的（RT-PCR后）的有甚么好建逸？？
希望多多指教啊
