【求助】实验通路设计，是否可行
丁香园论坛
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先谢谢各位大虾，小妹实验室新手，想做某个药物对EMT途径的抑制作用，涉及抑制PI3K/AKT途径。现在打算采用如下设计方法，**指正（作为硕士毕业论文）。
1. TGF-beta刺激上皮细胞发生上皮间质转化（EMT），测上皮细胞指标（较无TGF-beta刺激组下降），间质细胞指标（较无TGF-beta刺激组上升），pAKT, AKT（较无TGF-beta刺激组升高）。
2. 加入药物后，再次测上述指标（该药物是抑制EMT作用的），间质细胞指标，pAKT, AKT均较第1组下降，上皮细胞指标较第1组升高。
3. 采用IGF-1作为PI3K/AKT的激动剂，再看上述指标的变化，按说，是可以拮抗药物的作用的。
希望各位大虾帮我看看，欢迎指正，谢谢先。
要是哪位有IGF-1作为PI3K/AKT的激动剂使用的好文献，麻烦发给我，邮箱：xuli198602289@126.com，不胜感激！！
1. TGF-beta刺激上皮细胞发生上皮间质转化（EMT），测上皮细胞指标（较无TGF-beta刺激组下降），间质细胞指标（较无TGF-beta刺激组上升），pAKT, AKT（较无TGF-beta刺激组升高）。
2. 加入药物后，再次测上述指标（该药物是抑制EMT作用的），间质细胞指标，pAKT, AKT均较第1组下降，上皮细胞指标较第1组升高。
3. 采用IGF-1作为PI3K/AKT的激动剂，再看上述指标的变化，按说，是可以拮抗药物的作用的。
希望各位大虾帮我看看，欢迎指正，谢谢先。
要是哪位有IGF-1作为PI3K/AKT的激动剂使用的好文献，麻烦发给我，邮箱：xuli198602289@126.com，不胜感激！！
相关文献很多，最好能画出通路图来，这样看着比较好看。我大致看了一下你的实验设计基本可行。不知是否有EMT的激动剂，如果有，设一组EMT激动剂处理组，正向激活通路，再观察相应指标，更能说明问题。PI3K/AKT 是处在通路的上游还是下游，没有说清楚，如果是上游的调控因素，那应该相应的用AKT激动剂和抑制剂处理，观察效应指标。
你可以在NCBI上搜一下Sui X and Ren X，都是药物对伪狂犬病毒的抑制作用的文章，具体是哪篇我忘了，就是针对PI3K/AKT通路进行的
预祝 实验设计顺利、完整
预祝 实验设计顺利、完整
EMT是一个过程，主要的变化是细胞形态方面的变化。可能要有细胞形态变化的观察，这是做EMT研究必须的基础。
EMT过程的启动，是由一些关键的转录因子调控的，比如：Snail ;slug;ZEB1等等，可能在你的设计中要检测相关转录因子的表达水平的变化。
IGF-1是有文献报道作为AKT的激活剂，但是它的其他方面的作用不知道。而且你在做后面的激活AKT的实验时，是不是要加TGF-beta, 药物，IGF-1三种东西到你的细胞中，会不会太复杂了。建议你能够和别人要到组成型活性的AKT的表达载体，转入到你的细胞中，这样分析可能比较好。
个人观点，仅供参考。
EMT过程的启动，是由一些关键的转录因子调控的，比如：Snail ;slug;ZEB1等等，可能在你的设计中要检测相关转录因子的表达水平的变化。
IGF-1是有文献报道作为AKT的激活剂，但是它的其他方面的作用不知道。而且你在做后面的激活AKT的实验时，是不是要加TGF-beta, 药物，IGF-1三种东西到你的细胞中，会不会太复杂了。建议你能够和别人要到组成型活性的AKT的表达载体，转入到你的细胞中，这样分析可能比较好。
个人观点，仅供参考。
你的这个设计是没有问题的。但是你的PI3K/AKT指标实际上需要测两种：一个是PI3K/AKT的蛋白表达量， 一个是PI3K/AKT的蛋白激酶活性（磷酸化与被磷酸化）。 此外，我看你是打算药物刺激作用后提取PI3K/AKT蛋白做检测，而不是直接Elisa检测PI3K/AKT， 这涉及到你提取蛋白时PI3K/AKT活性是否会丧失问题。而蛋白表达量检测，只要有蛋白抑制剂存在就没有太大降解问题，但需要做Western Blot；本身Western Blot测蛋白含量也很复杂（如：提取蛋白，蛋白上样前定量，跑电泳， 转膜，加一抗二抗，显影等）。
所以，我认为楼主还不如直接做个基因表达谱芯片：
（1）TGF-beta组-------（2）TGF-beta组+加药------（3）TGF-beta组+加药+IGF-1， 培养一定时间后检测所有基因的差异表达。
每组做2个重复，共6个样本， 做一下各组药物作用后导致它们间的基因表达差异，那样因为不用做到蛋白，没有蛋白含量和活性的烦恼，就已经可以判断你研究的信号通路的重要性了， 而且得到的信息比你的研究要全面完整。
所以，我认为楼主还不如直接做个基因表达谱芯片：
（1）TGF-beta组-------（2）TGF-beta组+加药------（3）TGF-beta组+加药+IGF-1， 培养一定时间后检测所有基因的差异表达。
每组做2个重复，共6个样本， 做一下各组药物作用后导致它们间的基因表达差异，那样因为不用做到蛋白，没有蛋白含量和活性的烦恼，就已经可以判断你研究的信号通路的重要性了， 而且得到的信息比你的研究要全面完整。
ahzzr3711 wrote:
相关文献很多，最好能画出通路图来，这样看着比较好看。我大致看了一下你的实验设计基本可行。不知是否有EMT的激动剂，如果有，设一组EMT激动剂处理组，正向激活通路，再观察相应指标，更能说明问题。PI3K/AKT 是处在通路的上游还是下游，没有说清楚，如果是上游的调控因素，那应该相应的用AKT激动剂和抑制剂处理，观察效应指标。
我的实验设计方案图大概是这样的
[img]file:///C:/Documents%20and%20Settings/Administrator/Application%20Data/Tencent/Users/364587256/QQ/WinTemp/RichOle/GKP))9NE~YWNP2%Q_B`]C]9.jpg[/img]
希望帮我指正，还有老板经费不足，估计做这个实验费用只能控制在1w左右，如果做转染，可能超出预算了。
实验草图
fghostyun wrote:
你的这个设计是没有问题的。但是你的PI3K/AKT指标实际上需要测两种：一个是PI3K/AKT的蛋白表达量， 一个是PI3K/AKT的蛋白激酶活性（磷酸化与被磷酸化）。 此外，我看你是打算药物刺激作用后提取PI3K/AKT蛋白做检测，而不是直接Elisa检测PI3K/AKT， 这涉及到你提取蛋白时PI3K/AKT活性是否会丧失问题。而蛋白表达量检测，只要有蛋白抑制剂存在就没有太大降解问题，但需要做Western Blot；本身Western Blot测蛋白含量也很复杂（如：提取蛋白，蛋白上样前定量，跑电泳， 转膜，加一抗二抗，显影等）。
所以，我认为楼主还不如直接做个基因表达谱芯片：
（1）TGF-beta组-------（2）TGF-beta组+加药------（3）TGF-beta组+加药+IGF-1， 培养一定时间后检测所有基因的差异表达。
每组做2个重复，共6个样本， 做一下各组药物作用后导致它们间的基因表达差异，那样因为不用做到蛋白，没有蛋白含量和活性的烦恼，就已经可以判断你研究的信号通路的重要性了， 而且得到的信息比你的研究要全面完整。
感觉茅塞顿开，只是经费紧张，又想发篇好点的文章。
一般表达谱也就两三千左右一个样本，做蛋白用抗体进口的也要几千吧，据我所知，激酶检测试剂盒应该也不便宜。楼主如果想快点发文章的话，这应该算是一种选择吧。最近一直帮医院客户做这些，觉得你的研究跟他们很类似，有感而发。
wangch84 wrote:
你可以在NCBI上搜一下Sui X and Ren X，都是药物对伪狂犬病毒的抑制作用的文章，具体是哪篇我忘了，就是针对PI3K/AKT通路进行的
预祝 实验设计顺利、完整
不好意思，我看了文章，好像没有哪篇是做PI3K/AKT的，能把文章发给我不，谢谢！
fghostyun wrote:
一般表达谱也就两三千左右一个样本，做蛋白用抗体进口的也要几千吧，据我所知，激酶检测试剂盒应该也不便宜。楼主如果想快点发文章的话，这应该算是一种选择吧。最近一直帮医院客户做这些，觉得你的研究跟他们很类似，有感而发。
你好，如果我是做表达谱的话，除了“一般表达谱也就两三千左右一个样本”这个费用，以及我养细胞、药物的费用，我还需要其他的费用吗？我要比较性价比。做的表达谱里面能检测几个指标呢？是不是检测的指标越多，价格越贵，我想知道细节，你可以加我QQ：364587256.
你做表达谱也不便宜，分几组就至少几个样品。
抗体进口的几千，又不是少用抗体，干吗买进口？
再说fghostyun[url=http://i.dxy.cn/profile/fghostyun][/url]提示过你可以直接Elisa检测PI3K/AKT。
你是学生就是学习的，做一下Western Blot怕啥？
抗体进口的几千，又不是少用抗体，干吗买进口？
再说fghostyun[url=http://i.dxy.cn/profile/fghostyun][/url]提示过你可以直接Elisa检测PI3K/AKT。
你是学生就是学习的，做一下Western Blot怕啥？
364587256 wrote:
你好，如果我是做表达谱的话，除了“一般表达谱也就两三千左右一个样本”这个费用，以及我养细胞、药物的费用，我还需要其他的费用吗？我要比较性价比。做的表达谱里面能检测几个指标呢？是不是检测的指标越多，价格越贵，我想知道细节，你可以加我QQ：364587256.
不需要其他的费用。检测指标当然越多越贵，比如测定甲基化程度，启动子转录子，微RNA基因沉默，多态性位点（SNP）突变，定制某类蛋白活性的检测芯片(如：包括AKT在内的某一信号通路内蛋白的活性检测）等指标，这个是不同类型的芯片，成本另算。
一般做表达谱能得到的信息：
1. 各组加药组之间的所有基因的差异表达，差异表达程度：如AKT等是否特异性高表达；
2. 改变了哪些信号转导通路，哪个信号转导通路是最重要的
3. 改变了哪些基因功能（Gene Ontology） ，哪个生物学反应过程或功能是罪重要的
4. 组与组之间的关系聚类（红绿对比热图Heatmap， cluster）
观天 wrote:
你做表达谱也不便宜，分几组就至少几个样品。
抗体进口的几千，又不是少用抗体，干吗买进口？
再说fghostyun[url=http://i.dxy.cn/profile/fghostyun][/url]提示过你可以直接Elisa检测PI3K/AKT。
你是学生就是学习的，做一下Western Blot怕啥？
发SCI文章时用的图谱，如做Western Blot， 至少中科院系统内我知道很多人不信国产抗体。当然我不否认咱们国产抗体也有好的抗体。做Western Blot， 就一个beta-actin内参抗体就需要几千了吧，还不包括AKT的一抗，二抗，转印膜， 蛋白定量试剂盒，显影试剂盒，医学胶片之类的试剂或耗材。
当然愿意累死累活天天跑电泳，过夜转膜的话，做Western blot是没有问题。我做过很长一段时间的western， 想想实在不是还在学校时期的学生能轻松胜任的，加上学校的条件还没有中科院好。
做Elisa 检测PI3K/AKT也是可以的，只是提取的PI3K/AKT活性如何保持是个头疼的问题，这个有待探讨。能解决的话，这也是一个好的研究方法。美中不足是解决了活性问题，仍没解决蛋白表达量问题。
呵，其实师兄/弟、姐/妹一直做差不多的课题，买抗体、完整的一套试剂、耗材一直用还是划算的。我们做Western blot无论干转、湿转都不过夜。一次实验一天半吧，算上配试剂——两天。不过这个实验确实需要有经验的人指导才好些。
做表达谱就是筛选，的确能发文章，不过有些学者很反对这样做——没有深入系统的研究。不过也没办法，发文章、毕业、晋职称第一。fghostyun说表达谱2个重复，共6个样本，一个样本两三千左右，在不需要摸索条件、不做ahzzr3711所说激动剂处理组的情况下，也能满足364587256的要求。
做表达谱就是筛选，的确能发文章，不过有些学者很反对这样做——没有深入系统的研究。不过也没办法，发文章、毕业、晋职称第一。fghostyun说表达谱2个重复，共6个样本，一个样本两三千左右，在不需要摸索条件、不做ahzzr3711所说激动剂处理组的情况下，也能满足364587256的要求。
观天 wrote:
呵，其实师兄/弟、姐/妹一直做差不多的课题，买抗体、完整的一套试剂、耗材一直用还是划算的。我们做Western blot无论干转、湿转都不过夜。一次实验一天半吧，算上配试剂——两天。不过这个实验确实需要有经验的人指导才好些。
做表达谱就是筛选，的确能发文章，不过有些学者很反对这样做——没有深入系统的研究。不过也没办法，发文章、毕业、晋职称第一。fghostyun说表达谱2个重复，共6个样本，一个样本两三千左右，在不需要摸索条件、不做ahzzr3711所说激动剂处理组的情况下，也能满足364587256的要求。
老板没有钱，但是希望能发文章，所以我们做得都是精打细算。
观天 wrote:
呵，其实师兄/弟、姐/妹一直做差不多的课题，买抗体、完整的一套试剂、耗材一直用还是划算的。我们做Western blot无论干转、湿转都不过夜。一次实验一天半吧，算上配试剂——两天。不过这个实验确实需要有经验的人指导才好些。
做表达谱就是筛选，的确能发文章，不过有些学者很反对这样做——没有深入系统的研究。不过也没办法，发文章、毕业、晋职称第一。fghostyun说表达谱2个重复，共6个样本，一个样本两三千左右，在不需要摸索条件、不做ahzzr3711所说激动剂处理组的情况下，也能满足364587256的要求。
“深入系统的研究” 关键是看你的芯片数据的生物信息学分析那个人的功底了。分析好了，发《Nature》的也有。当然这种牛人一般采用的样本量超级大，如一两百个样本，然后聚类找出肿瘤分子标志物，用于疾病诊断。
当然大家愿意做western，能够把过程做熟练，也是很好的。
只是我不建议新手做，耗时耗力还不一定有好结果。往往一个内参beta-actin蛋白条带要调成一致就够新手折腾的了。而且发SCI文章没有漂亮的内参是不行的。
此外，“一天半” 时间 是因为 “观天” 你把细胞培养，加药， 提取蛋白，蛋白定量，内参蛋白条带调整均匀，蛋白电泳聚丙烯酰胺凝胶做好，特定蛋白电泳时间和电压、试剂转膜条件等都摸好的前提下实现的。我以前两次western一个接一个跑，平均下来，每个western还不用一天。
但是，要把这一套条件摸好，几个月也就下去了。
此外，天天与有神经毒性的丙烯酰胺凝胶打交道，对学生的身体损害只有天知道。
所以我从一个过来人的角度来看，如果重新选择，我不会去做western。
只是我不建议新手做，耗时耗力还不一定有好结果。往往一个内参beta-actin蛋白条带要调成一致就够新手折腾的了。而且发SCI文章没有漂亮的内参是不行的。
此外，“一天半” 时间 是因为 “观天” 你把细胞培养，加药， 提取蛋白，蛋白定量，内参蛋白条带调整均匀，蛋白电泳聚丙烯酰胺凝胶做好，特定蛋白电泳时间和电压、试剂转膜条件等都摸好的前提下实现的。我以前两次western一个接一个跑，平均下来，每个western还不用一天。
但是，要把这一套条件摸好，几个月也就下去了。
此外，天天与有神经毒性的丙烯酰胺凝胶打交道，对学生的身体损害只有天知道。
所以我从一个过来人的角度来看，如果重新选择，我不会去做western。
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