🔥 TOPflash 实验检测 wnt 通路的激活情况

TOPFlash(报告基因质粒) 是用于检测 Wnt 信号通路中β-catenin 介导的 TCF/LEF 转录活性水平的报告基因质粒。

TOPFlash 是以 pGL6-TA 为模板，在其多克隆位点插入两组 TCF/LEF 结合位点序列，每组有三个重复序列，一组为正向序列，另一组是它的反向互补序列，可以高灵敏度地检测 TCF/LEF 的转录活性水平。

LEF 和 TCF 与 Groucho 结合能够抑制 Wnt 调控的下游基因表达，同时细胞核内β-catenin 和 TCF/LEF 形成转录复合物能够激活 Wnt 信号通路下游的基因表达，因此可以用来检测 Wnt 通路的激活情况。

作为重要的信号通路之一 Wnt 信号通路与干细胞多能性、胚胎发育、肿瘤的发生等都有着密切的关系，其关键步骤是关键因子β-catenin 的稳定性及是否进入细胞核内，从而决定 Wnt 信号下游基因的表达。

当细胞外缺少 Wnt 蛋白时，细胞浆内的β-catenin 被招募到由 APC 及 Axin 等组成的降解复合物上，β-catenin 被 CK1α和 GSK3β 磷酸化，从而导致其与 E3 泛素连接酶 β-TrCP 的结合并进入泛素化和蛋白酶体依赖的降解途径。

因此在非激活状态下，细胞浆内的 β-catenin 蛋白水平保持着较低的水平，而细胞核内 LEF 和 TCF 与 Groucho 结合抑制了 Wnt 调控的下游基因表达。
当 Wnt 蛋白结合到受体复合物时，相应的信号通路就被激活。

在细胞核内 β-catenin 和 TCF/LEF 形成转录复合物，从而激活了 Wnt 信号通路下游的基因如 c-Myc 和 cyclin D1 等的表达，由于 TCF/LEF 转录活性水平与萤光素酶的表达量成正比，因此可以测定细胞内 Wnt 信号通路的激活水平。

TOPFlash 被广泛应用于 Wnt 信号通路的研究，通常用 FOPFlash（D2503） 带有突变的 TCF/LEF 结合位点序列作为其阴性对照。

材料：

1. NIH3T3 或 HEK293 细胞系

2. 纯化的活性 Wnt3a 蛋白

3. 胎牛血清（FBS）

4. DMEM（高葡萄糖）

5. TransIT-2020

6. TCL/LEF-萤火虫荧光素酶表达构建体

7. pRL-SV40-海肾萤光素酶表达构建体

8. Dual-Luciferase @ Reporter Assay System

9. 生长培养基

10. Wnt3a 条件培养基：通过收集稳定表达 L-Wnt3a 蛋白的小鼠成纤维细胞的上清液，然后以 1:10 的比例在 DMEM + 2％ FBS + 1％ PS 中稀释来制备 Wnt3a 条件培养基。

11. 血清剥夺的媒体：DMEM 及 2％ FBS，含有各种浓度的 Wnt3a 条件培养基

设备：

1. T75 培养瓶

2. 24 孔组织培养板

3. 96 孔板

4. 离心机

5. 水浴加热锅

6. CO₂ 培养箱 

7. Berthold 光度计

一、从液氮培养基中培养低传代 NIH3T3 或 HEK293 细胞

1、在 37 ℃ 水浴中短暂解冻细胞

2、将细胞移液管放入 15 ml 离心管中，在 1 500 转离心 5 分钟。吹打抽吸培养基，将细胞重新悬浮在 15 ml 生长培养基中，并在 T75 培养瓶中培养 （细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 中以 1×10⁶ 的密度培养）。

3、当细胞生长到 60% 未融合时，分裂细胞。

4、在进行实际检测前，应将细胞株传代 1~2 次，然后按照实验条件将细胞装入 24 孔板中，每孔重复 3 次（5×10⁴ 个细胞/孔）。

二、转染

1、第 0 天：在 500 μl 完整培养基（DMEM/10% FBS）中种植细胞（密度如上所述）。

2、第 1 天：转染（使用比例为 7XTCL/LEF-firefly 荧光素酶：pRL-SV40- Renilla 荧光素酶为 10:1；使用 1.5 μl TransIT-2020/300 ng DNA/孔）

3、第 2 天：转染后 24 小时更换培养基（最佳）

4、第 3 天：换成去血清培养基。

5、第 5 天：裂解细胞（1×全细胞裂解缓冲液，由 Dual-Luciferase @ Reporter Assay System 提供）并从细胞裂解中收集不同的上清液（20 μl），将它们平板接种到 96 孔板中。

三、读取发光信号

1、解冻双荧光素酶报告试剂。

2、用 firefly 荧光素酶和 Renilla 荧光素酶底物试剂启动光度计。其中 firefly 荧光素酶底物是 D-荧光素的衍生物，萤火虫萤光素酶化学反应将产生氧化萤光素和 560 nm 的特定光信号，可由光度计检测到。Renilla 荧光素酶底物是 Coelenterazine 的衍生物，Renilla 荧光素酶反应可产生 Coelenterazine 并且光度计可以检测到在 480 nm 处的特殊光信号。依次加入 20 μl 每种底物，并立即通过光度计测量产生的光信号（光信号在环境温度下在光度计的封闭腔室中检测）。

3、检测 firefly 和 Renilla 荧光素酶信号（firefly 荧光素酶信号 560 nm 检测，Renilla 荧光素酶信号在 480 nm 检测）。

4、用矫正后的读数作图，分析数据。

1、荧光素见光易被氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。

2、如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约 5 h，在 -80 ℃ 可保存数月，不要反复冻融以避免酶活性的降低。

3、一些荧光仪在进行检测前需要 1~2 s 的稳定，因此建议在开机后过一段时间再进行检测操作。