【求助】快急死了，再次求助关于wnt通路中TOPflash/FOPflash
丁香园论坛
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困惑很久了，请有经验 有爱心的站友帮助一下！发现关于wnt的文献中，几乎都要做报告基因检测实验，有的用TOPflash/FOPflash，有的用PGL3 ，请问两者之间区别是什么，最后检测都需要用荧光照度仪吗？如果实验室没有的话可以用别的仪器取代吗？或者说，用别的实验思路去取代这个实验一下可以吗？我的实验是想做某一抑癌基因对wnt经典通路的影响，可不可以使抑癌基因在某癌细胞中再表达后，直接检测靶基因CyclinD1和cmyc的表达及β－catenin表达和定位变化，从而说明这个抑癌基因是通过制wnt经典通路发挥作用的？？？这样可以取代荧光素酶报告实验吗
我也是想做这方面的东西，相关的文献给几篇吧，一起交流
一般而言，topflash/fopflash是比较常用的检测β-catenin的系统，原理和所有的RLU一样，都是利用转录因子可以和特异性的靶位点结合进而启动下游的虫荧光素酶基因的表达。如果有人自己把TCF/TLF结合那段序列重新克隆至pGL3当然也可以，只不过需要证实一下其有效性。做这个实验只需要一个荧光素酶监测仪就行了。另外从实验角度讲，其实做信号通路，RLU只是最基础的一个实验，精华还是得WB，共聚焦之类的。本人曾经听一位比较牛的老板讲过，RLU的结果只是锦上添花，当和其他结果一致的时候可以放上去，不一致的时候就砍掉。
zhuqueleee wrote:
一般而言，topflash/fopflash是比较常用的检测β-catenin的系统，原理和所有的RLU一样，都是利用转录因子可以和特异性的靶位点结合进而启动下游的虫荧光素酶基因的表达。如果有人自己把TCF/TLF结合那段序列重新克隆至pGL3当然也可以，只不过需要证实一下其有效性。做这个实验只需要一个荧光素酶监测仪就行了。另外从实验角度讲，其实做信号通路，RLU只是最基础的一个实验，精华还是得WB，共聚焦之类的。本人曾经听一位比较牛的老板讲过，RLU的结果只是锦上添花，当和其他结果一致的时候可以放上去，不一致的时候就砍掉。
谢谢zhuqueleee啊，我看了好几篇分比较高的文献，发现几乎所有人都做了双荧光素酶检测来验证效应确实是通过wnt通路发挥作用的。那就是说只要用western和免疫荧光验证了这条通路上beta－catenin和下游靶基因的变化，也就能说明问题了吗？
当然有那个双荧光素酶系统是最好的，但是实在没有的话也没办法啊。用western和免疫荧光验证beta－catenin和下游靶基因的变化只是基础，只是说明你转染了这个抑癌基因的确是改变了catenin通路，但是你想要证明该抑癌基因是通过catenin通路来发挥作用还必须要通过抑制实验，如siRNA,DN,inhibitor等一系列实验来证实你的结果。这也就是信号通路研究中的经常涉及的“因”与“果”的关系，是研究信号通路必须要讨论的内容，但是很多人总是忽视。
希望能对LZ的实验有所帮助。
希望能对LZ的实验有所帮助。
可以自己构建一个就行，TOPflash/FOPflash其实也是验证APC/b-Catenin/Tcf-4 Pathway。cell这篇文章就是自己构建载体验证的。有兴趣可以参考一下。
Cell, Vol. 99, 335–345, October 29, 1999, Copyright ã1999 by Cell Press
PPARd Is an APC-Regulated Target of Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs
构建过程
The following oligonucleotide pairs were used for dimerization to construct corresponding reporters in pBV-Luc: 5’-CTAGCATGTCTT TGTACTCGATGTCTTTGTACTCG-3’ and 5’-CTAGCGAGTACAAAGACATCGAG TACAAAGACATG-3’ for p4XTRE1-Luc; 5’-CTAGCATGTC TTTGGCCTCGATGT CTTTGGCCTCG-3’ and 5’-CTAGCGAGGCCAAAGACATCGAGGCCAAAGACA TG-3’ for p4XmTRE1-Luc; 5’-CTAGCTTGGCTTTCATCTGATTGGCTTTCATCTG AG-3’ and 5’-CTAGCTCAGATGAAAGCCAATCAGATGAAAGCCAAG-3’ for p4XTRE2-Luc; and 5’-CTAGCTTGGCTTTCGCCTGATTGGCTTTCGCCTGAG-3’ and 5’-CTAGCTCAGGCGAAAGCCAATCAGGCGAAAGCCAAG-3’ for p4XmTRE2-Luc.
详细步骤链接
http://www.coloncancer.org/ppar/DetailedProcedures.html#DRE
退火后直接连入pBV-Luc就可以
addgene有这个载体pBV-Luc
Cell, Vol. 99, 335–345, October 29, 1999, Copyright ã1999 by Cell Press
PPARd Is an APC-Regulated Target of Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs
构建过程
The following oligonucleotide pairs were used for dimerization to construct corresponding reporters in pBV-Luc: 5’-CTAGCATGTCTT TGTACTCGATGTCTTTGTACTCG-3’ and 5’-CTAGCGAGTACAAAGACATCGAG TACAAAGACATG-3’ for p4XTRE1-Luc; 5’-CTAGCATGTC TTTGGCCTCGATGT CTTTGGCCTCG-3’ and 5’-CTAGCGAGGCCAAAGACATCGAGGCCAAAGACA TG-3’ for p4XmTRE1-Luc; 5’-CTAGCTTGGCTTTCATCTGATTGGCTTTCATCTG AG-3’ and 5’-CTAGCTCAGATGAAAGCCAATCAGATGAAAGCCAAG-3’ for p4XTRE2-Luc; and 5’-CTAGCTTGGCTTTCGCCTGATTGGCTTTCGCCTGAG-3’ and 5’-CTAGCTCAGGCGAAAGCCAATCAGGCGAAAGCCAAG-3’ for p4XmTRE2-Luc.
详细步骤链接
http://www.coloncancer.org/ppar/DetailedProcedures.html#DRE
退火后直接连入pBV-Luc就可以
addgene有这个载体pBV-Luc
好几天没有来坛子里了，谢谢zhao22840718的指点。我的问题是即使构建了T
OPflash/FOPflash，一般实验室用什么仪器来观察结果呢？不是都需要那个荧光照度仪吗？我们实验室没有这个仪器，只是载体的话还可以说服老板从公司买，这个仪器没有就没办法了啊
OPflash/FOPflash，一般实验室用什么仪器来观察结果呢？不是都需要那个荧光照度仪吗？我们实验室没有这个仪器，只是载体的话还可以说服老板从公司买，这个仪器没有就没办法了啊
非常感谢zhuqueleee 的指点，我能不能这样理解你所说的抑制试验呢？
需要用RNA干扰等技术来抑制通路中的下游组分后，再观察该抑癌基因是否还能发挥其本来的生物学功能？
需要用RNA干扰等技术来抑制通路中的下游组分后，再观察该抑癌基因是否还能发挥其本来的生物学功能？
圈子圈套 wrote:
好几天没有来坛子里了，谢谢zhao22840718的指点。我的问题是即使构建了T
OPflash/FOPflash，一般实验室用什么仪器来观察结果呢？不是都需要那个荧光照度仪吗？我们实验室没有这个仪器，只是载体的话还可以说服老板从公司买，这个仪器没有就没办法了啊
promega 的GLOMAX可以，你附近实验室或公共实验室有没有，如果不总做，可以将就一下别人的。
记号，有大用
楼主，你好！我现在也要使用TOP-flash荧光报告基因，请问在哪里可以买到？谢谢！
lz后来的实验进行的如何呢，因为我也做这个，和lz很相似。现在处于实验室新手，求指点。
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