【求助】wnt信号通路

有哪位前辈用EMSA检测过wnt通路Tcf-4的DNA结合能力，结果出的如何。我们实验室还没做过，我想了解一下EMSA实验步骤，打算做药物干预前后Tcf-4的DNA结合能力变化，请问是否可行？望高手多多指点！:)

没有作过wnt通路Tcf-4的DNA结合能力。不一定别人没有作过，你就做不出来。按照EMSA实验步骤进行，完成实验应该没有问题。不知道是做非放射性的EMSA还是放射EMSA。

非放射EMSA实验技术可以参照：
http://www.dxy.cn/bbs/thread/10756235

放射EMSA步骤提供一个：
http://www.dxy.cn/bbs/thread/11248560
EMSA的方法 程序:

1.探针的标记：
(1) 如下设置探针标记的反应体系：
待标记探针 (1.75pmol/微升) 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升
T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升
总体积 10微升
按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide
Kinase，混匀。
(2) 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
(3) 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
(4) 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标
记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
(5) 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
2。 . 探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如
下步骤操作：
(1) 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
(3) 在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
(4) 在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
(5) 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在
-20℃。
3。EMSA 胶的配制：
(1)
准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大
EMSA 胶的模具。
(2) 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
TBE buffer (10X) 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) 150微升
TEMED 10微升
(3) 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，
并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4。EMSA结合反应：
(1) 如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：
阴性对照反应：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
样品反应：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
探针冷竞争反应：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
未标记的探针 1微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
突变探针的冷竞争反应：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
未标记的突变探针 1微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
Super-shift反应：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
目的蛋白特异抗体 1微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
(2)
按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。

(3)
加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建
议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
5。 电泳分析：
(1)
用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X
的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
(2)
把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液
(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
(3)
按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓
冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
(4) 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边
缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

(5) 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

非常感谢！:)

从你的描述来看,我觉得不可行.你做的是药物刺激前后TCF4和DNA的结合能力,这种结合不是长时的,只是由于某种修饰或者相互作用的改变而造成的，所以你做EMSA时不可能检测到.再者一般认为TCF4和DNA是一直处于结合状态。
如果要想检测的话，我觉得应该用ChIP，如果你的抗体好的话，做这个不成问题。

昨天的回复太匆忙了，所以没有说清楚。
TCF4/LEF1它们是一直接合在DNA上面的，接受信号刺激之后，如Wnt ligand之后，与之相互作用的一些蛋白发生了改变，如beta-catenin 可以把一些co-repressor（Grouch,TLE)竞争掉，以此来激活下Wnt-responsive gene。所以我觉得你的方案不可行。如果是想做ChIP，也不能用TCF4，而应该选一些其它的因子，如HDAC, P300,catenin之类的。
不知道你是想做什么，如果你的药物能modulate Wnt通路，我想你可以有别的方法去做，而不是你说的EMSA。

鼓励一把! by kaige88