求 小鼠淋巴管内皮细胞提取方法

请问楼主最后找到原代提取方法了吗！谢谢！

1. 处死动物后，打开胸腔，分离胸导管，在胸导管上端结扎，切取10-15cm的一段。将胸导管放入预冷PBS中漂洗。

2. 在解剖显微镜下，用眼科剪和眼科镊剥除外膜的脂肪和纤维组织，然后用PBS反复冲洗管腔。

3. 将胸导管移入含PBS的大培养皿中，清洗3次。在胸导管的远端插入静脉留置针，并结扎固定。用PBS冲洗管腔后，将游离端结扎。用静脉留置针向管腔内注入消化液，至淋巴管充盈为止。在37℃条件下，消化10min。淋巴管的管壁较薄，灌注消化时间不宜过长，以免消化过度，引起成纤维细胞的污染。

4. 取出胸导管，在游离端剪一小口，用离心管收集消化液，然后用培养液冲洗管腔，收集消化液和冲洗液，以1000r/min，离心10min。离心后吸去上清液，用培养液轻轻混悬细胞。

5. 将细胞接种于培养皿或培养板中，培养24h后补充培养液，继续培养。每隔2-3d换液1次。换液时，吸去1/2-2/3培养液，再加入新鲜培养液。

6. 原代培养4-6h后，大部分细胞已贴壁生长。24h后，内皮细胞形成由数个细胞组成的细胞群。淋巴管内皮细胞的活性较低，原代培养时细胞生长缓慢。2-3周后，细胞生长形成单层。淋巴管内皮单层呈卵石状特征性排列，可传代培养。

小鼠淋巴管内皮细胞:

1. 取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3.细胞传代

1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次:

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3min左右;倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终上消化;

3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5%COz细胞培养箱中培养;

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

小鼠淋巴管内皮细胞注意事项:

1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月

2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作

3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态

4、该细胞只可用于科研