动物淋巴管内皮细胞的分离

基本方案1：灌注消化法

实验材料：

1. 哺乳动物胸导管淋巴管

2. 1×PBS，含青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml，pH7.4

3. 0.2%Ⅰ型胶原酶

4. 眼科剪，眼科镊

5. 慕丝线（7号线）、细铁丝

6. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 处死动物后，打开胸腔，分离胸导管，在胸导管上端结扎，切取10-15cm的一段。将胸导管放入预冷PBS中漂洗。

2. 在解剖显微镜下，用眼科剪和眼科镊剥除外膜的脂肪和纤维组织，然后用PBS反复冲洗管腔。

3. 将胸导管移入含PBS的大培养皿中，清洗3次。在胸导管的远端插入静脉留置针，并结扎固定。用PBS冲洗管腔后，将游离端结扎。用静脉留置针向管腔内注入消化液，至淋巴管充盈为止。在37℃条件下，消化10min。淋巴管的管壁较薄，灌注消化时间不宜过长，以免消化过度，引起成纤维细胞的污染。

4. 取出胸导管，在游离端剪一小口，用离心管收集消化液，然后用培养液冲洗管腔，收集消化液和冲洗液，以1000r/min，离心10min。离心后吸去上清液，用培养液轻轻混悬细胞。

5. 将细胞接种于培养皿或培养板中，培养24h后补充培养液，继续培养。每隔2-3d换液1次。换液时，吸去1/2-2/3培养液，再加入新鲜培养液。

6. 原代培养4-6h后，大部分细胞已贴壁生长。24h后，内皮细胞形成由数个细胞组成的细胞群。淋巴管内皮细胞的活性较低，原代培养时细胞生长缓慢。2-3周后，细胞生长形成单层。淋巴管内皮单层呈卵石状特征性排列，可传代培养。

基本方案2：植块培养法

实验材料：

1. 哺乳动物胸导管或肠系膜淋巴管

2. 1%明胶铺底，置超净台晾干

3. 1×PBS，含青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml，pH7.4

4. 眼科剪，眼科镊

5. 慕丝线（7号线）、细铁丝

6. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 处死动物后，打开胸腔，分离胸导管，在胸导管上端结扎，切取10-15cm的一段。将胸导管放入预冷PBS中漂洗。

2. 在解剖显微镜下，用眼科剪和眼科镊剥除外膜的脂肪和纤维组织，然后用PBS反复冲洗3次。用虹膜剪纵向切开管腔，再用PBS冲洗管腔面。然后，将管腔剪成约1mm3 的小块。

3. 将组织快放入培养皿中，使内膜面朝下，放入37℃，含5%CO2 的孵箱中培养4h。加入培养液，胸导管组织块能否贴壁是内皮细胞培养的关键。因此，加入培养液时操作要轻，以免使组织块浮起。

4. 静置培养3d后换液，以后每隔2-3d换液1次。培养4-6d后，内皮细胞开始自植块长出，细胞呈长梭形或多边形。2-3周后，细胞生长形成单层。待细胞生长形成单层时，可传代培养。