树突细胞的分离实验

基 本 方 案 1 塑 料 黏 附 和E A 玫 瑰 花结 富 集DC

此种技术用于分离DC已经使用了很多年，其间只经过了微小的修改（Steinman衫aZ.， 1979)

材 料（带V 项 目 见 附 录 1)

胶原酶消化的脾脏细胞悬液（见辅助方案）

高密度牛血清白蛋白（BSA) 溶液

R P M I 1640 培 养 基（如 Life Technologies) ， 4℃和 37°C

R P M I - 5 完全培养基， 4°C和 37°C

抗体偶联的绵羊红细胞（EA)

用于流式细胞分析的一抗（表 2. 3. 2)

用 于 流 式 细 胞 分 析 的 二 抗（突 光 结 合 的 小 鼠 抗 大 鼠 I g G 和 I g M ; 如 BoehringerMannheim)

Beckman G H -3. 7 和 Sorvall HS-4 转子

15m l和 50m l聚丙烯锥底管

填充棉花和未填充棉花的高压灭菌的9in (约23c m ) 巴氏吸管，直 径 60m m 的组织培 养 皿（如 Falcon)

1 . 将胶原酶消化的脾脏细胞悬液于4°C ， 280 g 离 心 lOmin，弃上清。用 高 密 度 B S A 迅速重悬沉淀物，每个脾脏约lml。

2 . 准 备 B S A 柱 ：将 5 〜 6m l 细 胞 悬 液 加 入 15m l 离 心 管 中 ，在 悬 液 上 小 心 加 入 4°C 1.5m l 的 R P M I -1640培养基，形成一明显的界面。用 此 种 方 法 准 备 4 或 5 个 B S A柱 ，直至分完细胞悬液。

3 .将 B S A 柱 于 4°C ， 9500 g 离 心 15 min，缓慢加速，注 意 关 掉 「brake」开关。

4 . 小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面的细胞，吸 走 全 部 的 R P M I -1640和顶部l m l B S A ，将细胞转移至另一干净的50m l 离 心 管 中（弃沉淀）。用 4°C 的 R P M I -1640充满离心管以稀释B S A ，缓慢摇动混匀。

5.于4°C ， 280 g 离 心 I O m m 后弃上清。重 悬 细 胞 于 5〜l O m l R P M I -5完全培养基后置于冰上。

6 . 台盼蓝染色计数活细胞（附 录 3C ，一个脾脏可得到IO7 个低密度的脾脏细胞）。

7 . 用 R P M I -5完 全 培 养 基 调 整 细 胞 密 度 至 大 约 IO⁷ 个细胞/ml。每 4m l 悬液接种至60m m 培养皿内直至全部细胞铺板完毕。培 养 90miri使 D C 黏附。

8 . 弃非黏附细胞：用填充棉花的巴氏吸管吸取37°C R P M I -1640培养基，小心清洗培养皿表面，去除悬浮的细胞，直至培养皿表面由粗糙浑浊变为光滑并近乎清亮。重复洗涤一次。

9 . 每个培养皿加入4 ml 37°C R P M I -1640培养基并培养30〜60m i n 以去除黏附的淋巴细胞 。重复步骤8。

10.于倒置显微镜下利用相差观察培养皿。可见大部分深色星形树突细胞、一些明亮扁平的巨噬细胞，以及淋巴细胞、单核细胞之类的圆形细胞。如果树突细胞比例不高 ，则重复步骤8 、 9。

11.用 4m l 干净的R P M I -5完全培养基替换每个培养皿中的液体，培 养 12〜20 h 。

12.用填充棉花的巴氏吸管吸取37°C R P M I -5完全培养基洗涤平皿。将洗下来的细胞转移入置于冰上的15m l 离 心 管 中（每 管 可 装 3 个平皿的洗涤细胞）。用 2m l R P M I -5完全培养基洗涤平皿。重复该操作直到培养皿内的细胞收集完毕。

13.将收集的细胞于4°C ， 280 g 离 心 lOmin，弃上清。用 I m l 干 净 的 R P M I -5完全培养基重悬细胞后置于冰上。

14.台盼蓝染色计数活细胞（0.5X 10⁶〜I.O X l O ⁶ 个细胞/脾 脏 ，约 8 0 % 为 D C )。

15.按每个白细胞5 0 个 E A (抗体偶联的绵羊红细胞）的量加入E A (以 结 合 B 细胞和巨噬细胞），颠倒混勻。 4°C ， 70 g 离 心 lOmin。离心后不弃上清，直接将离心管置于冰上30 min。

16.吸弃部分培养基，剩 下 2〜2. 5 ml。用填充棉花的巴氏吸管轻微吹打细胞悬液10〜1 5 次以吹散大的团块但是不破坏玫瑰花结。

17.将重悬的细胞用血球计数器检查以确认是否每个玫瑰花结都是一个白细胞周围围绕着红细胞。如果有必要，再次悬浮细胞。

18.制 备 B S A 柱 ：将 5m l 高密度的B S A 加 入 至 15m l 的离心管中，小 心 地 将 2.5m l 玫瑰花结悬液加到液面上，从而形成一清晰的界面。
19•离心并收集细胞同步骤3〜6 (2X 105〜7 X 105 个细胞/脾脏 ，大 于 9 5 % 为 D C )。

20.用 表 2. 3. 2 中的抗体标记D C 用流式细胞仪检测其纯度。对于二抗，用荧光结合的小鼠抗大鼠Ig G 和 IgM 。

辅 助 方 案 胶 原 酶 消 化 制 备 脾 脏 细 胞 悬 液

用胶原酶消化的脾脏细胞悬液获得的D C 数量是用非消化法直接磨损脾脏获得的2〜3 倍（单 元 2.1)。这种方法也能够松解位于动脉周围鞘部位的D C 。

材 料（带V 项 目 见 附 录 1)

4000U /m l 胶 原 酶 D ，溶化后置于冰上

H B S S ，已灭菌，含 Ca2+ 、 M g 2+ (购置于 LifeTechnologies)

小鼠脾脏

皮下注射针， 22 G X l M i n 内 径（BectonDickinson)

10m l 、 5m l —次 性 注 射 器（如 Becton Dickinson)

IOOmm直 径 培 养 皿（如 Falcon)

2 个高压灭菌的锯齿状解剖镊（如 Roboz)

高压灭菌的不锈钢网.•将4 0 目的不锈钢网剪成5c m X 5c m 的小方格，向下折叠边缘 ，然后将四边弯成浅的矩形碗；锡箔纸包裹后高压灭菌。

1.将2 管 I m l 的 4000U /m l 胶 原 酶 D 稀 释（足够用于2 0 个脾脏）： Im l 加 入 9m l H B S S(稀 释 至 400U /m l ，步 骤 8 使用）， I m l 加 入 39m l 的 H B S S (稀 释 至 100U /ml)。置
于冰上。

2 . 将 22 G 针头连接在I O m l 的注射器上，充 满 l O O U / m l 的胶原酶。将 I O m l 的 l O O U / m l溶 液 加 人 I O O m m 的培养皿中。

3 . 取另外一个直径I O O m m 的培养皿进行操作。一只手拿镊子，另一只手拿注射器，拇
指放在活塞上。用 镊 子 夹 住 小 鼠 脾 脏 ，用 针 头 刺 入 脾 脏 被 膜 的 狭 窄 边 缘 ，注入100U /m l 胶 原 酶 100/xl。用镊子将脾脏推向针头，使针头前进几毫米。重复注射胶原酶 ，继续直到I m l 胶原酶都注射入脾脏，针头从另一端刺穿脾脏。

4 . 用针头撕开脾脏，将其转移至含胶原酶的培养皿中（步 骤 2)。重复操作，直到所有脾脏都注射和撕开。

5 . 从第二个培养皿中收集细胞悬液加入到置于冰上的50m l 离心管中。用 3m l l 00U/ml的胶原酶漂洗培养皿后加到上述50m l 离心管中。

6 . 加 入 3ml l 00U /m l 胶原酶至培养皿中。将撕碎的脾脏依次转移至培养皿。用 2 个镊子将它们撕成边长I m m 的小碎块，使其能通过5m l 吸管的内径。当所有的脾脏都撕碎 后 ，将先前放置脾脏碎块的培养皿中的胶原酶溶液加入进来，用 5m l 吸管猛烈吹打多次。

7 . 倾斜培养皿，将大块碎片除开，将细胞悬液转移至第5 步的置于冰上的50m l 离心管中。用几毫升lOOU/m l 的胶原酶洗涤培养皿后加入至离心管中。

8 . 在培养皿留下的脾脏碎块中加入IOml 400U /m l 的胶原酶。吹打数次后于培养箱里放置 30〜90 min。

9 . 在孵育的最后阶段，猛烈吹打碎片， 将其吸至直径I O O m m 培养皿的无菌钢网上。

10.用镊子固定钢网一端，用 几 毫 升 lOOU/m l 胶原酶洗涤碎块，然 后 用 无 菌 的 5m l 注射器活塞碾磨碎块。捣烂直到所有的红色物质从组织中去除。再用几毫升lOOU/ml胶原酶洗涤钢网。

11.将钢网从培养皿中拿开，丢弃无色的黏附的被膜碎块。猛烈的吹打培养皿中的液体 ，将其转移至步骤7 的 50m l 离心管里。用 几 毫 升 l O O U / m l 胶原酶洗涤培养皿后一同加入到离心管中（约 有 0 . 5 % 为树突细胞或者更少）。

12.如果需要，即可用高密度的B S A 离 心（见基本方案1)。

基 本 方 案 2 用 小 鼠 骨 髓 前 体 细 胞 培 养 树 突 细 胞（DC)

此 方 法（Inaba ， 1 9 9 2 ) 克 服 了 组 织 中 可 利 用 的 「内 源 性 A P C 」数量的有限性 。 一 旦培养成功，大量 的 D C 可用作细胞生物学的研究、遗传性状修饰、体内免疫。此种方法在研究D C 分化的生物学中也非常重要。

材 料（

6〜7 周 龄 小 鼠（最好为雄性鼠，因为它们的骨头比较粗大；运输后需要休息至少5天 ；不要使用应激或脱水的老鼠）

7 0 % 乙醇

冰冷的以及室温的R P M I -1640培 养 基（如 Life Technologies)

氯化铵溶液 〇• 02mol/L Tris • C U p H 7. 2 (附录I) /0•14mol/L N H 4Cl

裂 解 淋 巴 细 胞 的 抗 体（杂交瘤上清）（可选）。例 如 ，杂 交 瘤 R A 3-3A 1 (B 2 2 0 抗体 ； A T C C 号 TIB146)、 G K 1.5 (C D 4 抗 体 ； A T C C 号 Tffi 207)、 3.155
(C D 8 抗 体 ； A T C C 号 TIB211)、 M 5/114 ( M H C I I 抗 体 ； A T C C 号TIB1 2 0 ) —见 单 元 1. 3

兔 补 体（Pel-Freez)

R P M I -5完全培养基

小鼠G M - C S F (m G M -C S F ) : 可以来源于纯化的重组蛋白，也可来源于转染小鼠G M - C S F 基 因 的 细 胞 系 的 条 件 培 养 基（瑞 士 巴 塞 尔 A . Lanzavecchia博士赠送）

用 于 流 式 细 胞 检 测 D C 的 抗 体 ：如 M H C I I 类 分 子 的 杂 交 瘤 上 清（A T C C 号TIB120)、 B 7-2/C D 86 的 杂 交 瘤 上 清（Pharmingen)、 D E C -205 的 抗 体( A T C C 号 H B 290)

解剖用品

无菌纱布垫

I O O m m 培 养 皿（如 Falcon)

3 ml 注射器 25 G ， 5/8in (1.58c m ) 针头

9in (23c m ) 巴 氏 吸 管（填充棉花并高压灭菌）

Nytex 滤 器（3-40/26; Tetko)

15m l 和 50m l 聚丙烯锥底管

2 4 孔 培 养 板（如 Corning)

1 . 取小鼠股骨和胫骨，保存在置于冰上的R P M I -1640培养基中，直到所有的小鼠准备完毕。去除骨头上的肌肉（通常在无菌纱布垫上操作）后 ，将干净的骨头置于新的平皿里。然 后 在 含 7 0 % 乙醇的培养皿里浸泡骨头2 min，最 后 用 冷 R P M I -1640培养基 洗 涤 2 遍 。

2 . 用 剪 刀 减 去 骨 的 两 端（骺）然后将其转移到另外的培养皿中。用 注 射 器 吸 取 2 mlR P M I -1640培养基冲洗骨髓腔以获得骨髓。在另一培养皿里剁碎骨骺。将剁碎的骨骺以及从骨髓腔里冲洗出来的骨髓混合在一起，用吸管打碎团块，将悬液通过筛网(去除颗粒）后 收 于 15m l 或 者 50m l 的离心管里。

3.加入3〜I Oml 的氯化铵溶液裂解红细胞。室温静置3m i n 后 ，室温， 280 g离心IOmin(1200r/min Beckman G H -3. 7 转子），弃上清。

4 . 去 除 淋 巴 细 胞（可选）：将细胞配成I X l O ⁷ 个细胞/m l ，加入合适浓度的杂交瘤上清(通常1 : 2 0 终浓度）和 兔 补 体（通 常 1 : 17〜1 : 2 0 终浓度）。 37°C 水浴培养lh，每
20m i n 振荡一次。

作者 用 了 B 220抗 体（杂交瘤R A 3-3A 1)、 C D 4 抗 体（杂 交 瘤 G K 1. 5)、 C D 8 抗体（杂交瘤3.155)和1MCHII抗 体（杂交瘤M5/114)。

5 . 用 R P M I -1640洗 涤 骨 髓 细 胞 2 次 ，室 温 ， 280 g 离 心 l O min。 计 数 活 细 胞（附录3 0 。 用 R P M I -5完全培养基调整细胞浓度至I X l O ⁶ 个细胞/m l 。

6 . 加入小鼠重组G M -C S F 至终浓度为700〜lOOOU/m l 或 者 20ng/ml。将细胞悬液一般每只小鼠可以得到4 X 10⁷〜5 X 10⁷ 个 骨 髓 细 胞（没有去除淋巴细胞）按 Iml/孔接种
2 4 孔板。

7.每两天洗涤细胞一次，每次移出旧的培养基，然 后 倾 斜 2 4 孔 板 用 R P M I -1640轻轻地沿孔壁洗涤细胞后吸出洗涤液，最 后 加 入 I m l 新 的 含 700〜lOOOU/ml (约 20ng/ml) m G M - C S F 的 R P M I -5完 全 培 养 基（步 骤 6)。

8.可选：验证聚集物的特征—M H C II类分子存在于不成熟 D C 的 胞 内 小 室（M H CII小室或者MIIC) 通 过 标 记 [3 H ] 胸腺嘧啶，可 发 现 1 0 % 〜2 0 % 的细胞处于S 期 ，用 流 式 细 胞 仪（单 元 4,1和单 元 4. 2 ) 分析，细胞中度表达膜M H C II类分子，但是
不 表 达 B 7-2/C D 8 6 共刺激分子。到 第 6 天 ， 培 养 板 孔 中 布 满 很 多 聚 集 体 或 者 球 形 的 处 于 增 殖 期 的 非 成 熟 D C 。

9.在 第 5〜8 天 期 间（此时已产生足够的聚集体），用 R P M I -1640或 R P M I -5培养基轻轻吹打，将聚集体从贴壁的基质细胞上脱离下来（此后几天一直会有聚集体产生）。收集脱离的细胞，室温， 280 g 离 心 lOmin，弃上清。用 R P M I -5培养基重悬，最高
浓 度 为 I X l O ⁶ 个细胞/ml。然后铺在直径为I O O m m 的培养皿中，每 个 培 养 皿 10m l ，最 多 铺 I X l O⁷个细胞。

10.于细胞转移后24〜48 h 期间 ，每 24 h 轻轻摇晃培养皿，收集非贴壁、非增殖、成熟的 D C ，转移至另外的收集管中用于后期的研究。

11.计 数 活 细 胞（附 录 3 0 。用 流 式 细 胞 仪（单 元 4 . 1 和 单 元 4. 2 ) 或者用血球计数板(附录3C ) 计 数 大 的 形 状 不 规 则 的 细 胞 来 检 测 D C 得 率 （每 只 动 物 通 常 获 得 5 X
IO⁶〜IOXlO⁶个细胞，> 6 0 % 表达成熟D C 的表面标志）。