材料与仪器
细胞
辛醇 PMSF
搅拌机 光学显微镜
辛醇 PMSF
搅拌机 光学显微镜
步骤
1. 检测所用细胞数量。
2. 收获细胞前在冷环境中强力搅拌时，在所有溶液中加入蛋白酶抑制剂。
3. 在培养基 A 中加入辛醇，混合均匀。
在培养基 A 中加入辛醇和 PMSF，即为培养基 B。
4. 用吊桶式转头在 250 ml 的圆锥离心瓶中于 2℃，1500~2000 g 离心 5 分钟收获细胞。
5. 快速倒出上清，搅拌松动沉淀。
6. 直接在培养基 B 中重悬沉淀细胞。
细胞破碎
7. 在冷的搅拌机中高速搅切 30~60 秒破碎细胞。
8. 用光学显微镜检查匀浆物，载玻片上放少量匀浆物，加上甲基绿。保证小核已从其临近大核的“杯状”处被移去。
差异核片状沉淀
9. 将搅拌过的细胞倒入圆锥形离心瓶中，用吊桶式转头在 0~4℃ 于 1500~2000 g 离心 5 分钟。可用 50~250 ml 的离心瓶。
10. 轻微摇动瓶，使上清表面形成的表层松动，将上清和表层倒入冷的搅切机中。
11. 用少量细胞核洗涤缓冲液重悬片状沉淀，用甲基绿染色后在光学显微镜下仔细观察小量、检测大核和小核的数量。
12. 将片状沉淀收集到试管中，标记为 Pn。
13. 高速搅切上清 20 秒，用较高速度离心 5 分钟。
14. 收集上清，在细胞核洗涤缓冲液中重悬片状沉淀，按照步骤 11 检测细胞核。
15. 重复搅切和离心，提高离心速度，分析每次的片状沉淀，直到沉淀中几乎没有大核为止。
16. 当最后观察的片状沉淀中小核为大多数时，高速搅切上清 20 秒，用吊桶式转头在 0~4℃ 于 5000 g 离心 5 分钟。
17. 收集上清，将片状沉淀悬于细胞核洗涤缓冲液中，按照步骤 11 检测片状沉淀。
计数分离的细胞核总数
18. 集中适当的含有大核的片状沉淀；小核也同样。用细胞核洗涤缓冲液重悬核于适当的体积内。
19. 用甲基绿稀释少量的大核或小核。用分光光度计计数细胞核数量，计算基于起始细胞的数目。假定生长或饥饿过程中每个细胞有一个大核和一个小核；接合过程中每个细胞的细胞核数量依赖于所处阶段有很大变化。
20. 当大核和/或小核收量合适，可在 0~4℃ 于 2000 g 离心 5 分钟收获细胞核。
21. 在少量细胞核洗涤缓冲液中重悬细胞核，用小离心管离心 5 分钟洗涤细胞核。
2. 收获细胞前在冷环境中强力搅拌时，在所有溶液中加入蛋白酶抑制剂。
3. 在培养基 A 中加入辛醇，混合均匀。
在培养基 A 中加入辛醇和 PMSF，即为培养基 B。
4. 用吊桶式转头在 250 ml 的圆锥离心瓶中于 2℃，1500~2000 g 离心 5 分钟收获细胞。
5. 快速倒出上清，搅拌松动沉淀。
6. 直接在培养基 B 中重悬沉淀细胞。
细胞破碎
7. 在冷的搅拌机中高速搅切 30~60 秒破碎细胞。
8. 用光学显微镜检查匀浆物，载玻片上放少量匀浆物，加上甲基绿。保证小核已从其临近大核的“杯状”处被移去。
差异核片状沉淀
9. 将搅拌过的细胞倒入圆锥形离心瓶中，用吊桶式转头在 0~4℃ 于 1500~2000 g 离心 5 分钟。可用 50~250 ml 的离心瓶。
10. 轻微摇动瓶，使上清表面形成的表层松动，将上清和表层倒入冷的搅切机中。
11. 用少量细胞核洗涤缓冲液重悬片状沉淀，用甲基绿染色后在光学显微镜下仔细观察小量、检测大核和小核的数量。
12. 将片状沉淀收集到试管中，标记为 Pn。
13. 高速搅切上清 20 秒，用较高速度离心 5 分钟。
14. 收集上清，在细胞核洗涤缓冲液中重悬片状沉淀，按照步骤 11 检测细胞核。
15. 重复搅切和离心，提高离心速度，分析每次的片状沉淀，直到沉淀中几乎没有大核为止。
16. 当最后观察的片状沉淀中小核为大多数时，高速搅切上清 20 秒，用吊桶式转头在 0~4℃ 于 5000 g 离心 5 分钟。
17. 收集上清，将片状沉淀悬于细胞核洗涤缓冲液中，按照步骤 11 检测片状沉淀。
计数分离的细胞核总数
18. 集中适当的含有大核的片状沉淀；小核也同样。用细胞核洗涤缓冲液重悬核于适当的体积内。
19. 用甲基绿稀释少量的大核或小核。用分光光度计计数细胞核数量，计算基于起始细胞的数目。假定生长或饥饿过程中每个细胞有一个大核和一个小核；接合过程中每个细胞的细胞核数量依赖于所处阶段有很大变化。
20. 当大核和/或小核收量合适，可在 0~4℃ 于 2000 g 离心 5 分钟收获细胞核。
21. 在少量细胞核洗涤缓冲液中重悬细胞核，用小离心管离心 5 分钟洗涤细胞核。
来源：丁香实验
