方案27.1 淋巴细胞的分离

通过右旋糖酐促沉降作用去除红血细胞后，将枸橼酸或肝素抗凝的全血或血浆层加在致密的 Ficoll-Hypaque 层上面。离心后，大部分淋巴细胞位于 Ficoll-Hypaque 和血浆之间的界面。

肝素或枸橼酸抗凝的血液样本 D-PBSA Ficoll-Hypaque
无血清培养液
带有钝头插管的注射器 塑料Pasteur吸管或移液器 血细胞计数器或电子细胞计数器 离心机

1. 用枸橼酸或肝素抗凝容器采集血液标本（肝素或枸橼酸抗凝的血液样本，枸橼酸或肝素的浓度依收集容器而定。透明的离心管或普通容器），然后送到实验室。

2. 用 D-PBSA 按 1：1 稀释后，将 9 ml 血液加在 6 ml Ficoll-Hypaque （将比重调整为 1.077 g/cc）上。使用带盖的粗大透明离心管如 25 ml Sterilin 或 Nimc 普通容器，或在 50 ml 透明的塑料 Corning 离心管中加入双倍的液量。

3. 离心（400 g，15 min），这是在界面中心测量的离心速率。

4. 不要搅动界面，小心地吸出血浆和 D-PBSA 层。

5. 带有钝头插管的注射器或塑料巴斯德吸管收集含有淋巴细胞的液层，然后用无血清培养液如 RPMI 1640 将其稀释至 20 ml。

6. 将稀释的细胞悬液离心（70 g，10 min）。

7. 弃去上淸液，用 2 ml 无血清培养液混悬沉降细胞。如果需要洗几次（如除去血清因子），可再用 20 ml 无血清培养液混悬细胞，离心 2 次或 3 次。最后，用 2 ml 无血清培养液混悬沉淀细胞。

8. 取一份细胞样本，用美蓝染色，然后用血细胞计数器计数有核细胞。取另一份细胞样本，用 Zapoglobin (Beckman Coulter) 溶解，利用 70~100 μm 口径的管在电子细胞计数器上计数细胞核。

淋巴细胞与一些血小板和单核细胞集中于一层。虽然在步骤 3 离心的大部分粒细胞主要见于 Ficoll-Hypaque 中，但有些粒细胞可位于淋巴细胞层。通过利用单核细胞和粒细胞附着玻璃（微珠或培养瓶内表面）或尼龙网的特点，能将单核细胞和残留的粒细胞从淋巴细胞层中除去。如果需要分离更纯的细胞，可利用特异性淋巴细胞亚群的表面标志物，用 MACS 或 FACS 进行阳性分选。

1. 人的血液可能受到 HIV 、肝炎病毒或其他病原体等的感染，在操作时应当特别小心。

2. 不要用玻璃 Pasteur 吸管和带有锐利针头的注射器加注入的血液，但可用 1 ml 移液器或带有钝头插管的注射器。