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淋巴细胞及其亚群的分离

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  为研究免疫细胞的功能,常需高纯度的淋巴细胞或其亚群,分离方法介绍如下。
  一、纯淋巴细胞群的采集
  通常利用单核细胞在37℃和Ca 2+ 存在条件下,能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性,据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法,藉以获得高纯度的淋巴细胞群。
  (一)粘附贴壁法
  将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中,移至37℃温箱静置1h左右,单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上,而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞,继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象,用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。
  (二)吸附柱过滤法
  将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中,凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中,从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行,对细胞极少损害。
  (三)磁铁吸引法
  利用单核细胞具有吞噬的特性,在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒,置37℃温箱内短时旋转摇动,待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后,用磁铁将细胞吸至管底,上层液中含较纯的淋巴细胞。
  二、淋巴细胞亚群的分离
  分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法;而选择性去除不要的细胞,仅留下所需的细胞是为阴性选择。常用以下几种方法:
  (一)E花环沉降法
  本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合,待淋巴细胞形成E花环后,继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞,而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理,使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解,则获得纯的T细胞。
  (二)尼龙毛分离法
  本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性,可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛(聚酰胺纤维),均匀充填在内径5~6nm的聚乙烯塑料管(饮料管即可)内,经Hanks液浸透保温,将单个核细胞悬液加入柱内,放37温箱静置1~2h。用预温的含10%~20%小牛血清培养液灌洗,洗脱液内含有非粘附的T细胞,重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管,此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90%以上,B细胞纯度可达80%。
  (三)亲和板结合分离法
  利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群,其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性,将相应抗体结合于塑料平板上,继加细胞悬液,凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合,抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取(图20-3)。同样若用特异性抗原交联在塑料板上,则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触,可引起细胞激活,因此,凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时,本法更适用。如要分离CD4 + 或CD8 + 细胞,则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样,用活化的C3包被,可分离出有C3受体的细胞。

图20-3 亲和分离法图解

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