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淋巴细胞的分离技术

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实验原理

混合的单核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,这是获得富含T细胞群的有效方法。

实验设备

1. 尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。

2. 烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。

3. 装填尼龙毛柱,一次性注射器。

实验材料

取自然沉降的上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。

实验步骤

1. 尼龙毛的清洗与干燥

1) 戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。

2) 冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干。

3) 重复1)、2)步骤6次。

4) 将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2~3天后,贮藏在带盖的方盘内。

2. 装尼龙毛柱

1) 取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管。

2) 将尼龙毛梳理,并适当折叠,以适应注射器的直径,填入注射器内,约20ml的体积。

3) 将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌。

3. 细胞分离

1) 将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门。

2) 将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞/ml。

3) 将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱。盖上注射器,37℃温育45min至1h。

4) 打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中。

5) 离心,即获所需的T淋巴细胞。

6) 关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。

注意事项

1. 此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的松紧也有关系。

2. 此法的T淋巴细胞的回收率约20%~30%。

3. 用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗。

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