氧敏感蛋白的分离技术:以[4Fe-4S]-FNR为例

一、4Fe-FNR 的厌氧分离

2.1 纯 化 O₂不 稳 定 的 4Fe-F N R 的 原 理 和 程 序

2.1.1 实现和维护无氧环境的一般准备

在蛋白质纯化之前，常用的程序必须适于为蛋白质纯化过程中使用的所有化学品、溶液和设备建立并保持无氧环境(Sutton and Kiley, 2003)。这通常可以通过建立通气站(sparging station)和使用厌氧手套箱( C o y Laboratory Products 公司 ，M o d e l A )来实现。一个通气站通常由氩气或氮气罐、提供铜擦洗(copper-scrubbed， Sargent-Welch furnace)气体的设备和一个定制的歧管组成(图42.1)。通气系统通过将惰性气体分散入装有O₂敏感固体试剂[如连二亚硫酸钠(D T H )]的丁基橡胶密封的玻璃小瓶, 去除化学品中的痕量 O₂，或去除用于蛋白质分离和鉴定的溶液中的溶解的O₂。为了这个目的，歧管装备有多个管线，各条管线连有气体分散管( U p c h u r c h Scientific)或针管（图 42. 1)。标准针管也可用于通气。手套箱为蛋白质纯化过程中的储存和操作提供足够的空间。厌氧室(vinyl c h a m b e r)充满了由 8 0 % N 2、1 0 % 0 ) 2和 1 0 % H 2组成的气体混合物, 可以使任何进入到箱中的O₂都 与 H₂通过钯催化剂反应，生成水被干燥剂吸收。在厌氧环境下，F P L C或 H P L C 纯化系统用于纯化蛋白质是有优势的，因为密封条可以抵抗氧扩散，并且较新的设计也足够紧; 奏(体型小），可在厌氧室内操作(假设最小产热）。此外，它们大部分都是自动化设计，在厌氧室中操作更容易。然而 ，如果使用较老款式的 F P L C ，则需要将大多部分部件，包括泵、柱和检测系统放置在厌氧室之外并与厌氧室内的缓冲液及组分收集器通过不透氧的 P E E K 管 (U pchurch Scientific)相连接（图 42. 2)，所以整个系统的内部是保持厌氧的。溶液通过 F P L C 的路径, 从位于厌氧室内的液体容器流到厌氧室外的泵和/或柱中, 然后回到厌氧室内的组分收集器中（图 42. 2)。大多数的溶液(如缓冲液)在通过空气阀进入厌氧室前，首先通入氩气至少20 m in, 然后在厌氧室中至少平衡12 h 后方可使用。所有玻璃器皿和塑料物品至少在厌氧室中平衡24 h 后方可使用，以确保减少任何无意中引入厌氧室的氧气。

人诱导阶段大量积累的F N R 无辅基酶蛋白中，这些培养物倒人一个9 L 大口玻璃瓶中，并 在 4°C通入氩气过夜。我们很幸运地发现上述过程比在稳定厌氧环境中表达更有效，我们最近发现与有氧条件相比较, 在厌氧条件下两个铁-硫簇的生物合成路径都被减弱(M e t t e r t e t a L , 2008)，可以提供这一现象的内在机制。为培养物通氩气的大口玻璃瓶酉己备了两孔瓶塞，分别插着两根玻璃管: 第一根连接氩气罐的管线至气体分散管，触到接近玻璃瓶的底部; 第二根较短(3〜4 英寸），允许气体从通气容器中释放。经过过夜通气步 骤 ，菌体很快倒人一个大小适合放入空气阀的容器(4 L 烧杯），并立即转移到厌氧室中 ，在这里菌体分配在已经在厌氧室平衡超过24 h 的 500 m L 离心瓶中。在将离心瓶移出厌氧室前, 将离心瓶上带O 形密封环的盖子(B e c k m a n )紧紧密封。菌 体 在 4°C 8000 r/m i n 离心沉淀15 m i n ( B e c k m a n Avanti J-25离心机 ， J L A 10. 500转头）。然后离心瓶返回厌氧室内，倒去上清液, 重复步骤直至所有菌体都收集完毕。此时，无氧的菌体沉淀可以储存在-80°C或立即用于裂解。

2.1.3 菌体裂解物的制备

菌体裂解基本根据S u t t o n 和 Kiley(2003) 的描述，是将含有还原剂的厌氧菌体悬液以 20 000 psi的压力通过法兰西压榨器(French press), 并在收集瓶中持续注人氩气。这一步的最大技术挑战是维持缺氧条件。为了尽量减小菌体与O 2的接触，一个预冷的法兰西压榨器容器和含有缺氧菌体沉淀的瓶子首先在空气阀中经过两个循环放入厌氧室。立刻用厌氧缓冲液冲洗法兰西压榨器容器两遍 = 通 常 ，菌 体 沉 淀在补加连二亚硫酸钠(D T H )和二硫苏糖醇(D T T )的厌氧缓冲液 A 中重悬(至原始 体 积 的 〇.5 % ) (表 42.1)，并且用吸管立即转移到冲洗过的预冷法兰西压榨器容器中。将装有菌体悬液的法兰西压榨器容器密封，其样品出口管连接带帽的1 8 号（18-gauge)针 头 ，然后将整个容器从厌氧室中移出。一旦容器装配进法兰西压榨器，针头就被插入带有丁基橡胶盖子的玻璃瓶中，这个玻璃瓶预先用氩气通气，用于收集菌体裂解物。在 20 000 psi压力下单通过法兰西压榨器之后，厌氧裂解物被收集到密封的玻璃瓶中，然后马上拿回厌氧室，转移至超速离心管中并且在移出厌氧室内前用气密盖密封。 4°C 、45 000 r/m i n 超速离心 60min(Beck-m a n O p t i m a L E -80K , 70. I T i rotor)以移除菌体碎片。然后将样品拿回厌氧室内，上清液 作 为 4F e-F N R 蛋白质分离的来源。

2.1.4 蛋白质的纯化

[4Fe-4S]-FNR 的常规使用配备 5 m L BioR e x -70 阳离子交换柱（BioRad Laboratories) 的 F P L C ( P h a r m a c i a L C C -501 Plus 系统）纯化。缓冲液都放置于厌氧室内 ，通过厌氧室的端口，经 由 PEEK管泵出至外部F P L C 。在分离菌体裂解物之前，B i oRex-70柱用含 有 D T T 和 D TH 的厌氧缓冲液B 和 A 冲 洗 I h ，并在缓冲液A 中平衡。含 有 FNR的菌 体 裂 解液拿到厌氧室外之前首先被转移到一个超级环（s u p e r b o p )中，密封好，并 与 上样环连接。 4F e - F N R 通过以流速10 m L / h 的 0. 1〜0. 55 m o l / L K C l 的梯度洗脱，然后通过 P E E K 管泵回样品室内，P E E K 管连接厌氧室内的组分收集器。根据电导仪测量值,F N R 被 约 0. 4 m o l /L 氯 化钾洗脱下来。 由 于 [4Fe-4S]²⁺簇 在 420 n m 对可见光有最大吸收峰，故其呈现独特的绿 色 。 随后收集 有 色 的组分，通过流过配备了 I m L B i o R e x - 7 0 阳离子交换树脂的重力流柱浓 缩 。 柱子储存在厌氧室并用厌氧缓冲液A 平 衡 。此 外 ，由 于还 原 剂 D T T 和 D T H 的存在会干扰随后4P V F N R 的生物化学性质鉴定, 这一步同样可用于去除蛋白质溶液中的这些还原剂。通过这个方法得到的 4 F e - F N R 呈现特殊的深绿色 ，并 含 有 约 I.0m m o l / L 的蛋白质，其簇保有率约8 0 % 。

2.2 操作规程

逐步分离4F e -F N R 的操作规程总结如下® 。

第一天

(1) 在下午早些时候, 将菌种P K 827接 种 于 100 m L 含 有 I m L 2 0 % 葡萄糖、50ul的 200 m g /m L 苄氨青霉素(A p )的 L B 培养基，37°C 培养过夜。

(2) 准 备 并 高 压 灭 菌 4个 2L 烧瓶，每瓶含有 l L l X M 9(M m er， 1972)基本培养基。

第二天

(1) 在 每 I L 的 M 9 培养基中加入:10 m L 2 0 % 的葡萄糖、10 m L 2 0 % 酪蛋白水解物(casamino acid)、2 m L 维生素 Bi (硫胺素）（2 m g / m L 储备液）、1 m L M g S O 4 (I m o l / L 储备液）、100 /JL Ca C l 2(l m o l / L 储备液）、I m L 柠檬酸铁铵(10 m g / m L 储备液，过滤除菌）、250 uL A p (200 m g / m L 储备液，过滤消毒）。

(2) 4 个 摇 瓶 每 个 都 接 种 10 m L 过 夜 培 养 物 到 I L M 9 完全培养基中。 37°C 、约200 r/m i n 摇 至 O D w m n 值 为 0•3。通 过 加 I m L 0•4 m o l / L I P T G 到每个摇瓶中（最终浓
度 为 至 〇.4 m m o l /L )诱 导 F N R 的合成，并 再 摇 I h 。

(3) 将菌体加人 9 L 瓶中，在 4 °C通 人 氩 气 14〜 16 h 。

(4) 准备第二天要用的溶液和玻璃皿，放人厌氧室中(通常厌氧室配备标准移液设备和 tip头 、离心机、涡流器和离心管）。

① 溶液。

缓冲 液 A : 准 备 600 m L ，分 别 分 装 500 m L 和 100 m L 至 螺 丝 帽 玻 璃 瓶 中（配方见表 42.1)。

缓冲 液 B : 准 备 600 m L , 分 别 分 装 500 m L 和 100 m L 至 螺 丝 帽 玻 璃 瓶 中（配方见表 42.1)。

缓冲液 C :100 m L 到螺丝帽玻璃瓶中（配方见表42.1)。

缓冲 液 E :100 m L 到螺丝帽玻璃瓶中(配方见表42. 1)。

水:100 m L 瓶 。

调整氩气流以产生稳定气流，经 过 本 章 2.1节描述的定制的通气系统（图 42. 1)，利用置于缓冲溶液底部的分气管( U p c h u r c h Scientific)向溶液中通人氩气20 m i n 。

② 放人厌氧室中的玻璃管和塑料制品有: 两个超高速离心管和盖帽、组分收集管、装废液的烧杯、带有密封环的柱塞和帽、玻璃瓶(5个 或 6 个 小号,2个中号）和丁基橡胶帽、玻璃巴斯德移液管、4〜6 个瓶帽带有◦ 环的离心瓶、500m L 带刻度量筒、2 L 和 4 L 塑料烧杯、25m L 玻璃移液管、巴斯德吸管洗耳球、法兰西压榨器的针头和试管。

将这些物品经过空气阀放入厌氧室中, 把缓冲液盖子打开并平衡12 h 。

第三天

(1) 将通气的菌体从9 L 摇 瓶 倒 人 4 L 塑料烧杯中，立即用保鲜膜和胶带封住。将烧杯放入厌氧室中，分装每份450 m L 到 500 m L 离心瓶中并盖上盖子。

(2) 将离心瓶从厌氧室中取出，称重配平。不平衡的离心瓶子拿回厌氧室中调整内容物质量。在 8000 r/m i n 、4°C 离 心 15 m i n 。

(3) 离心后，将离心瓶送回厌氧室，移去上清。重复离心步骤，直到所有菌体都离心完毕。菌体沉淀应是军绿色。

(4) 在离心时, 称取154 mg DTT和 150 mL DTH分别到独立的I.5 mL EP管 中 ，立即盖上盖子。将它们与离心后的离心瓶一起放人厌氧室内。

(5) 在厌氧室内, 加I.5 m L 的缓冲液E 到 D T H 中 ，加 I.0 m L 的水 到 D T T 中。加300ul DTH( 终 浓 度 1 . 7 mmol/L)和100ulDTT（最后浓缩1.1.0mmol/L)到100ml缓冲 液 A 中。在 含 有 I.7 mmol/L D T H 和 I.0 m m o l /L 的 D T T 的 20 m L 缓 冲 液 A 中重悬菌体。菌体悬液可以立即用于菌体裂解，也可转移到中型玻璃瓶中, 用丁基橡胶瓶塞密封 ，在干冰上冷冻，然后移出厌氧室储藏在一 80 °C 冰箱直到准备好纯化。

第四天

(1) 在 500 mL的缓冲液A 和缓冲液B 中，分别加入上述新鲜配制的I.5 mL DTH和 0.5 mL DTT

(2) 将泵的引头( p u m p lead)放入缓冲液中，使缓冲液 A 与 泵 A 相连 ，缓 冲 液 B 与泵B 相连。

(3) 将 I3ioRex-70柱 连 人 F P L C 系统, 确保柱中没有气泡。

(4) 开 启 F P L C 程序，用 100% 缓冲液B (在厌氧室内)清洗柱子I h ，流速0.17 m L /m i n ，然 后 用 1 0 0 % 缓 冲 液 A 再 清 洗 I h 。

(5)将冷冻的菌体放人厌氧室内, 在厌氧条件下融化菌体悬液(不要在厌氧室外融化菌 体 ，否则氧气会进人玻璃瓶中）。

(6) 将法兰西压榨器容器放入厌氧室。用 含 有 D TT 和 D TH 的厌氧 缓 冲 液 A 冲洗样品容器两次。在样品容器中装满重悬菌体，密封，将样品出口与带帽的1 8 号针头相连，将样品容器与用于收集菌体裂解物的带丁基橡胶盖的玻璃瓶从厌氧室中取出。

(7) 将样品容器装入法兰西压榨器中，压榨器最好放在冷室中。为了从裂解提取物中排除氧气，将连接容器的针头插人收集瓶中，并在瓶中再扎人两根针管, 一根用于轻轻加人氩气，另一根用于排出气体。在 4℃ 、20 000 psi裂解菌体。

(8) 拔出针头，然后将菌体裂解液放人厌氧室中, 将裂解液分到两个超速离心管中。把它们拿出厌氧室，在离心前称重配平。不平衡的离心管放人厌氧室中调整质量。

(9) 用 70.1 Ti 转子在 4℃、45 000 r/min 离心 60 m i n 。

(10) 离心后，将离心管放入厌氧室，上清液倒人超级环(superloop)中然后密封。将超级环的另一端用缓冲液A 充满并密封。将 超 级 环 从 厌 氧 室 内 移 出 并 与 F P L C 系统相连 。

(11) 开 启 FPLC上 样 程 序 ，并 按 照 合 适 的 次 序 加 入 相 应 缓 冲 液 ，以 使 FNr 从BioRex-70柱中洗脱。

(12) 设定厌氧室内的组分收集器收集柱洗脱液。

第五天

浓缩与储存。

(1)含 有 4Fe-FNR组 分 很 容 易 根 据 其 颜 色 识 别 。将 这 些 组 分 倒 入 中 等 大 小 的 烧 瓶中 ，用 缓 冲 液 C 以 1 : 4 比 例 稀 释 。

⑵ 构 建 一 个 I m L的 BioRex-70的重力柱，用 2 倍柱体积的缓冲液B 清 洗 , 再 用 6倍柱体积的缓冲液C 清洗。

⑶将蛋白质溶液加载到柱上，用 2 倍柱体积的缓冲A 清洗，随后 用 〇.8 mol/L KCl缓冲液(由缓冲液B 和缓冲液C 配成)洗脱。只收集有颜色的液滴。

⑷ 将 浓 缩 的 4Fe-FNR分 装 到 0. 5 mL剪 掉 盖 子 的 EP管 中 ，然 后 将 EP管 放 到 小 玻璃 瓶 中 。玻 璃 小 瓶 用 丁 基 橡 胶 塞 盖 上 ，并 用 铝 盖 (Bellco公 司）密 封 。储 存 在 小 玻 璃 瓶 中的 蛋 白 质 样 品 ，立 即 在 干 冰 乙 醇 上 冻 结 ，通 过 空 气 闸 放 入 厌 氧 室 中 。用 这 种 方 法 ，样 品 可在 一 80°C 冰 箱 安 全 地 储 存 几 个 月 。解 冻 前 ，在 转 移 入 厌 氧 室 时 把 密 封 的 玻 璃 瓶 放 在 干 冰乙 醇 上 是 非 常 关 键 的 ，此 步 骤 用 以 阻 止 解 冻 过 程 中 将 O₂ 引 入 玻 璃 瓶 中 。

2.3 用于特殊用途的蛋白质的分离

2.3.1 从纯化的4F e-F N R 中去除痕量R N A 酶以用于体外转录分析

在经过两个B i oRex-70阳离子交换柱后，纯 化 的 F N R 蛋 白 通 过 S D S ——P A G E 估计的纯 度 高 于 9 5 % 。然 而 ，这 种 制 备 物 含 有 大 量 的 R N A 酶 ，足以在体外转录分析时降解R N A 产物。 R N A 酶活性随后可以通过与B e c k m a n H P L C 系统相连的大小排阻柱(H R -12 Superose， G E Healthcare)分离去除 (Mettert and Kiley， 2007)。 整个 H P L C 系统放置在厌氧室内并配置了 P E E K 管 ( U p c h u r c h Scientific)。由于用这种方法分离的 F N R将要用于体外转录分析，所有缓冲液溶液和组分收集管都要经过焦炭酸二乙酯（ diethylpyrocarbonate， D E P C )和/或高压处理。根据硫化物分析判断，用体积排阻色谱纯化也可产出接近 1 0 0 % 的二聚化的 4Fe^F N R ( M o o r e and Kiley， 2001)。

2.3.2 纯化⁵⁷F e 标记的4Fe-FNR用 于 Ntossbauer 光谱分析

M S s s b a u e r 光谱是一个强大的方法，可用于铁-硫簇的定性和定量分析（Beinert etal. ， 1997) 。 它基于铁原子核的超精细分裂模式的能量级别，以 及 γ 射线激发光谱或吸收光谱中铁原子核从基态跃迁至激发态所需要的能量来区别铁-硫簇类型。⁵⁷Fe 是到目前用 M S s s b a u e r 广谱研究的最常见的元素，并且因为含有铁-硫的蛋白质在生物界系统中扮演了重要的角色，M S s s b a u e r 光谱已被广泛用于表征这类蛋白质。为了制备富含⁵⁷F e 的4Fe -F N R ，我 们 将 1X M 9 培养基流经一个C h e k x 100(200〜4 0 0 目， B i o R a d )柱(每1 L 培养基用40 g 树脂)以去除生长培养基中天然富余的56F e , 并在生长培养基中以乙烯基硫酸氢二铵亚铁(ferrous ethylenediammonium sulfate)的形式补充57F e 。制备无铁生长培养
基和补充^F e 的步骤如下所述。

(1) 将 200 g C helex树 脂 和 约 200 m L 水加入到烧杯中，准 备 Chelex 100柱 。室温孵 育 30 m in后 ，将树脂倒入 250 m L 重力柱中。使用 前 用 5 倍柱体积的水冲洗。再生柱子时需要用2 倍柱体积的I m ol/L H C l冲洗，然后用 5 倍柱体积的水冲洗; 之后再用2 倍柱体 积 的 I mol/L N a O H 和 另 外 5 倍柱体积的水冲洗，直到柱子洗出液的p H 约 为 7. 0。

(2) 去除生长培养基中的铁: 将5 L 的 1 X M 9 培养基通过新制的或再生的 Chelex100柱。收集流出液, 高压灭菌。使用后的柱子储存于0. 5 m o l /L 的硫酸铵中。

(3) 菌体生长和含有⁵⁷F e 标记的[ 4 F H S ] 24簇 的 F N R 的分离。

① 将菌 株 P K 8 72接 种 于 100 mL L B 培养基中。在培养基中加I mL 20% 的葡萄糖和 50 uL 的 200 m g /m L 的氨苄青霉素, 在37°C培养过夜。

② 离心过夜的培养物以去除L B 培养基。加 100 m L 除 铁 的 I X M 9 培养基重悬菌体沉淀，4°C 、6000 r/m i n 离心，倒出上清液。

③ 将沉淀重悬于1〇〇 m L I X M 9 培养基中, 接种10 m L 菌 体 悬 液 到 I L 除 铁 的 M 9基本培养基，除了铁被替换为15 uL 含⁵⁷F e 的乙烯基硫酸氢二铵亚铁(I mol/L 储备液），其他添加成分如上文所述。培养物在与上文所述纯化非57F e 标 记 的 F N R —样的条件下培养, 包括通人氩气以使⁵⁷Fe 标记的[4Fe-4S ]²⁺簇装配人 F N R 。

④ 由于我们观察到一旦⁵⁷Fe掺入 4Fe -FNR中 ，在 [4Fe——4S ]簇中的⁵⁷Fe和溶液中的⁵⁷F e 的交换就很难发生，因此用于随后纯化的缓冲液(A 、B 和 C ) 是没有除铁的，并且纯化步骤和没有⁵⁷Fe 标 记 的 4F & F N R 的纯化步骤是一样的(本章2. 2 节)。

二、含FNR的[4Fe-4S]2+族蛋白质的特征

可以利用一些分析实验来表征纯化的4F e-F N R , 包括蛋白质浓度测定、铁和硫的含量测定、簇的保有率和类型以及簇的氧化状态。通 过 S D ^ P A G E 来估计每份蛋白质制备物 的 纯 度 ，通 常 大 于 9 5 % 。蛋 白 质 的 浓 度 通 过 Coomassie P l u s 蛋 白 质 分 析 试 剂（Pierce公 司 )测 定 ，并 除 以 因 子 1. 3 3 来 校 正 ，以 将 蛋 白 质 浓 度 标 准 化 至 氨 基 酸 分 析 测 定 结 果 (爱荷 华 州 立 大 学 蛋 白 质 中 心）。蛋 白 质 中 铁 和 硫 的 含 量 分 析 通 过 Beinert和 其 同 事 发 明 的方 法 测 量 (Beinert, 1983; K e n n e d y e t a U 1984)。纯 化 的 蛋 白 质 中 [4Fe-4S ]²⁺簇含量，通 过 每 摩 尔 F N R 蛋 白 质 中 硫 的 摩 尔 数 计 算 。也 同 样 可 以 通 过 [4F e-4S ]^2—簇 在 405 m n的 光 吸 收 值 测 定 ，已 知 其 消 光 系 数 为 16 125 m o l / ( L . Cm ) ( S u t t o n et al. ，2004)。 [4F e -4S ]²⁺簇 的 保 有 率 通 过 含 有 一 个 [4Fe-4S]²⁺簇 的 F N R 亚 基 的 百 分 比 来 决 定 。在 我 们 测 定的 超 过 1 0 0 个 F N R 制 备 物 中 ，我 们 特 别 观 察 到 铁 浓 度 要 稍 高 于 硫 的 浓 度 ，原 因 可 能 是 缓冲 溶 液 中 存 在 少 量 的 铁 元 素 污 染 , 但 这 些 铁 并 不 与 簇 结 合 。 因 此 ，我 们 用 硫 的 浓 度 来 确 定蛋 白 质 制 备 物 中 [4Fe——4S ]^2- 簇 蛋 白 质 的 浓 度 ，这 样 可 以 较 少 地 引 人 人 为 因 素 。

虽然[4Fe-4S]²⁺簇呈现出可见光吸收光谱的特征（Khoroshilova et al. ， 1995),Fe-S簇的类型和氧化状态只能通过利用57F e 标 记 的 F N R 蛋 白 质 的 M S s s b a u e r 光谱来测定(Khoroshilovaetal., 1997)。最近，傅立叶变换离子回旋共振(F T -I C R )质谱已经用于鉴定结核分枝杆菌中分离的无辅基酶蛋白（apo-)、[2Fe-2S ]-及[4F e 4S ]-形式的腺苷酰硫酸还原酶(Carroll et al. , 2005)，虽然目前还不清楚这一方法的通用性如何。

3.1 铁和硫的分析①

铁的含量由K ennedy等 (I 9S4 )描述的一个无灰化的快速过程测定。这个方法的原理是将样品蛋白质中所有的铁还原成Fe²⁺ ，然 后 加 入 Fe^2- 特 异 螯 和 物ferene{5,5’-[3-(2-pyridyl)-l ，2,4-triazine——5,6-diyl]bis-2-furansulfonic acid 的二納盐， Sigma 公司}，使它们 形 成 Fe^2- ferene复合物, 该复合物在593 n m 有高消光系数。在测量前准备a、b 、 c 三种溶液(表42.2)(K ennedyetal. ，1984)。蛋白质稀释缓冲液(缓冲液 D ，表 42.1)和半微量比色杯(路径长度I cm )至少在测量前一天放人厌氧室中。通 常 ，加 5 蛋白质样品和 95 缓冲 液 D 到厌氧室中的比色皿里; 用石错膜(parafilm)覆盖比色皿，之后将其从厌氧室中取出。之后在比色皿中加人100 试 剂 a ，混勻; 再加入1〇〇 p L 试 剂 b ，混 勻 ；用 parafilm 覆盖比色皿，30°C孵 育 15 m in。最后 ，加 人 5 斗 试 剂 c, 混勻 ，然 后 在 593 nm处测量吸光值。在这个测定中，1 n g 铁原子的分子吸光值为0.119。

硫 的 测 定 是 利 用 试 剂JV,IV-二甲基对苯二胺（N ,N-dimethyl-p-phenylenediamine,DMPD)与硫形成亚甲基蓝的半微量分析法，由 Beinert于 1983年发明。在这个方法中，会采取一些预防措施以避免S2- 以硫化氢气体的形式丢失, 这是一个通常发生在强酸和/或存在氧化剂的环境下(如氯化铁)的副反应。预防措施包括:①整个过程的操作都在一个 外 径 10 mm总 体 积 L 7 m L 的小玻璃管中进行，有一个锥形底部，并装有一个搅拌棒(10 mmX 3 mmX 3 mm)和一个玻璃塞;②在溶液为酸性或加人氧化剂时混合要轻柔，这个方法可减小管中液体的搅动和新的空气-水界面的形成，从而减少形成的硫化氢气体的逃逸;③溶液中加几滴酚酞，以监测轻柔混勻方法的混合效率;④用微量吸管将强酸性的DMFD溶液加人氢氧化锌悬液中，使较重的DMPD溶液在下层，较轻的溶液在上层。通常的方法如下。在测量前，玻璃管和水在厌氧室中平衡24 h。然后每个玻璃管中加人10ul蛋白质样品和90ul 水 ，盖上盖子将样品移出厌氧室。将玻璃管放在搅拌板上，加 人 300ul新鲜制备的1 % 的乙酸铸[Zn(C₂ H₃O₂)₂₊ 轻搅拌。然后, 迅速加人15ul 12% Na〇H 并大力搅拌，直 到 NaOH的纹影(schlieren)消失或酚酞的颜色均勻。室温卿育5 min后 ,75 uL1 % DMPD溶液(在5 mol/L H Cl中)位于蛋白质样品层下面的一层。轻轻搅拌溶液直到只有顶部2 mm的液层含有不溶性氢氧化锌或呈粉红色。然后在溶液中直接加入10 ul 23 mmol/LFeCl3( 于 1.2 mol/L H C l中），并 快 速 搅 拌 达 到 溶 液 均 勻（无 色）。在 20〜25°C赙 育 30 min后 ，离 心 15〜 20 min直 到 蛋 白 质 结 块 。上 清 液 转 移 至 比 色 杯 中 ，在670 nm、710 nm和 750nm测量吸收值。吸收值的比例大约应是A_670nm :A_750nm : A_710nm=3 : 2 : I . 硫 含 量 通 过 在 670 n m 的 34 500 m ol/(L . cm) 消 光 系 数 来 测 量（Beinert,1983) 。

3.2 I C P - M S 分析:7F e 标 记 的 4F e - F N R 中⁵⁷F e 含量

电感耦合等离子体质谱(I C P-M S )是一类质谱测定法，它对分析一系列金属有高敏感性 ，并且可以分辨同位素离子形态。这是一个分析大量自然的和实验的样品中⁵⁷F e 的理想方法。我们的蛋白质制备物最近利用威斯康星州 州 立 卫生实验室的—‘台Thermoscientific E L E M E N T 2 高分辨率 I C P-M S 进行了分析。具体而言，50 u L I M m ol/L 蛋白质样品转移到无铁试管中，密封并移出厌氧室，然后提交分析。根据上面所述的步骤分离蛋白质，得率通常为8 0 % 〜9 0 % ，约 8 0 % 的蛋白质簇含有⁵⁷Fe 。

3.3 [4Fe-4S]₂₊ 襄的紫外线可见光分光光度分析

紫外线可见光谱通常使用L a m b d a 2 紫外线可见光分光光度计(Perkin-Elmer公司）获得(Sutton etal. ， 2004)。将带螺丝盖的石英比色皿(I c m 路径长度，Star n a公司）放人厌氧室, 打开盖子，平衡24 h 。这些比色皿配有带〇环的螺旋盖以防止氧气的进人，因此可用于标准分光光度计。在厌氧室中, 适当稀释的蛋白质样品加人比色杯中，用螺丝盖密封并移出厌氧室。样 品 在 波 长 250〜 700 n m 扫描来获得蛋白 质 的 完 全 吸 收 光 谱 ，在405 nm的吸光值用于利用消光系数16 125 m ol/(L . c m )计算样品中[4F e-4S ]₂₊簇的浓度 （Sutton et al. ， 2004)。

3.4 M Q s s b a u e r 光谱分析

为 了 进 一 步 鉴 定 铁 -硫 簇 的 类 型 和 氧 化 状 态 ，在 卡 内 基 梅 隆 大 学 化 学 系 进 行 了MSssbauer 光 谱 学 分 析（Khoroshilova et al. ， I “ 5 ; I “ 7 ; Popescu et al. ， I “ 8 ) 。M Sssbauer杯 、盖 ，以 及 用 于 拧 紧 M Sssbauer杯 的 工 具 在 使 用 前 24 h 放 入 厌 氧 室 。大约400 uL 蛋 白 质 溶 液 加 入 定 制 的 M Sssbauer杯 中 ，封 上 盖 子 ，立 即 在 液 氮 中 冷 冻 整 个 杯 子 。使 用 空 气 闸 的 手 动 循 环 模 式 ，将 液 氮 小 心 放 人 厌 氧 室 中 。在 冷 冻 的 样 品 移 出 室 后 ，把样品转 移 到 MQssbauer光 谱 仪 中 分 析 。

3.5 低温电子顺磁共振

电 子 顺 磁 共 振 (EPR)光 谱 是 用 来 研 究 含 有 一 个 或 多 个 不 成 对 电 子 的 化 学 物 质 的 技术 ，这 些 化 学 物 质 ，如 有 机 和 无 机 的 自 由 基 ，或 含 有 过 渡 金 属 离 子 的 无 机 复 合 物 。铁-硫簇含 有 不 成 对 电 子 (Cammack and C o o p e r , 1993) ，因 此 该 技 术 对 与 研 究 铁 -硫 簇 的 特 异 氧 化状 态 是 很 有 用 的 。正 如 预 期 的 ，F N R 的 [4Fe——4S]2+簇 对 E P R 没 有 反 应 ，因 此 E P R 不 适合 表 征 纯 化 的 天 然 4F e -F N R 蛋 白 质 的 铁 -硫 簇 类 型 和 氧 化 状 态 。然 而 , 它 对 研 究 其 他 含有 顺 磁 离 子 的 铁 -硫 簇 蛋 白 质 （如 顺 乌 头 酸 酶 )是 一 个 强 大 并 应 用 广 泛 的 工 具 ( K e n n e d yetal, ，1984)。此 外 ,M 6ssbaUer 和 EFR 联 用 可 以 用 于 检 测 在 簇 的 转 换 或 一 些 蛋 白 质 的 销毁 (destruction) 过 程 中 出 现 的 铁 -硫 簇 中 间 体 。 E PR 的 样 品 制 备 与 Nfcssbauer光 谱 分 析 ，只需 要 一 种 特 别 的 注 射 器 以 加 载 长 管 口 的 EPR 管 。一 个 0.5 m L 的玻璃注射器配备一个长针管 ，用 来 吹 打 试 管 中 约 200 uL ( 约 100 umol/L )的 蛋 白 质 溶 液 ，然 后 迅 速 在 液 氮 中 冷 冻 。m