CTll-2细胞培养

1．CTLL-2细胞的培养：培养CTLL-2细胞的培养液是含有10％小牛血清和纯化IL-2（15～20IU/ml）或大鼠条件培养液（20％）的RPMI-1640培养液。一般在细胞培养瓶中接种2×104细胞/ml，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3天，细胞密度到达约2×105/ml时再稀释到2×104/ml，加入新鲜的IL-2或大鼠条件培养液继续培养。

2．大鼠条件培养液的制备：取3只以上300克左右的大鼠，断头处死，无菌摘取脾脏，置平皿中。用无菌注射器芯挤压脾脏通过200目的钢丝网分离单个脾细胞。洗涤后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞至5×106～10×106/ml，加入Con A（终浓度5～8μg/ml），在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时，收集上清液，分装后保存于－20℃。此即大鼠条件培养液。

3．CTLL-2细胞的冻存和复苏：

1）取培养2～3天的、生长旺盛的CTLL-2细胞，用细胞培养液配成2×107/ml。

2）在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜（或甘油）。混匀后密封。置4℃1小时，20℃ 2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸气上过夜后进入液氮中。

3）复苏时，从液氮中取出冻存管，立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入10ml含20％大鼠条件培养液，15％小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃ 5％ CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时，更换新鲜的上述培养液，继续培养。

4）约培养7天，待细胞形态正常后，每3天更换一次培养液。4周后用于检测IL-2。

4．用CTLL-2细胞检测IL-2的生物活性（[3H]脱氧胸苷摄入法）

1）用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次离心250×g 10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。

2）用台盼蓝染色法计数细胞并决定细胞的活力（活细胞应>85％），用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至5×105/ml。

3）取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40IU/ml稀释到0.019IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照只加细胞培养液。每孔加0.1ml

特征特性：悬浮生长

配养条件：RPMI1640+100U/mlrmIL-2(重组小鼠白介素-2)+10%FBS（推荐HAKATA优等胎牛血清货号）

传代方法：1：2传代