THP1细胞养久了容易抱团或者贴壁，然后还会有一些小黑点，应该怎么样培养？

细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。

细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的。

注意细胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基 严重泛黄，细胞数会增加。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。

THP-1细胞适合在细胞Ph环境偏酸性环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同Ph的1640。

传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后3～4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增;1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好;2）不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3） 使用1640（ATCC推荐），注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱; 4）注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存。

复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的。

要么是细胞碎片,要么你的细胞被污染了,如果细胞没满的话,你可以换一下培养液,如果又出现的话那就是污染了,丢弃!!

免疫细胞对血清要求比较高，建议换用进口的GIBCO的血清。

一般小黑点说明有污染，

支原体，有人曾认为小黑点可能是支原体污染，小黑点可以通过滤膜，可以在空气中传播。而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。

真菌

有很多人发现类似小黑点的，但最后确定是真菌，二性霉素B对其有效。那说明小黑点不存在只是细胞培养中的真菌感染，还是说明小黑点属于真菌类污染物。如果小黑点是一种真菌，那么由此引起的污染是不会引起那么多人的关注，即使它很特殊。但是这不能排除那些认为“小黑点”是真菌的细胞者，看到的只是一般真菌感染。由于细胞被感染了，要进行拯救处理，不像理论上那么简单，稍有不注意都是很容易导致培养失败，所以小黑点是一种真菌也是不太可能。

寄生类原虫

小黑点属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到它有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光；另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染小黑点的血清4周，直到满视野都是黑煤渣般的小黑点。给人的感觉是小黑点和细胞一样有丛集性，如果密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺，所以有人认为细胞旁分泌的某些因子可以抑制小黑点的生长。

那么如果您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，可采取下列步骤：

首先，要肉眼观察培养基是否混浊，

然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。

如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。

如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前没有任何变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关：

(1)细胞生长过老，破碎的细胞残骸;

(2)血清质量不好，反复冻融的结果;

(3)配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长;

(4)配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点;

(5)培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。