有关细胞冻存后 - 80℃保存的问题
可靠的陶同志
背景：百度和高年级同学说冻存细胞短时间可以放到 - 80℃，时间上短的有说三个月的，长的有说半年的。但是我去年年底冻了一批细胞，因为实验室液氮罐空了，就放到 - 80℃保存了三周。上周我取了一管细胞复苏，发现细胞几乎全部不贴壁，24 小时后贴壁细胞只有几十个（25 培养瓶），且背景中出现了小黑点（见细胞培养过程中出现疑似细菌污染）。因为活细胞很少，所以完全没法控制污染，细胞被团灭。我用的冻存配方一直是 7FBS：2DMEM：1DMSO，18 年中冻完第二天放液氮保存的复苏基本都没事，同学有用 631 配方的也没问题。但是我们整个课题组放在 - 80℃冰箱里保存的细胞几乎没有人复苏成功过。
所以我有几个问题不明白：
1. 细胞 --RT 冻存盒到 - 80℃-- 冻存盒中取出保存到 - 80℃冰箱，为什么我的细胞就撑不住三周呢？
2. 如果在 - 80℃放了三周，放液氮，过几天再取出来复苏，还有救么？
3. 我发现液氮罐中的塑料盒底常出现一层厚冰。理论上液氮罐中应该是纯液氮，那么为什么取出来的盒子底下会有水冰（确信，我捏过冰球），甚至会冻住冻存管冻在盒子里拔不出来。
希望各位战友帮忙指点迷津，谢谢大家！
4 个回答
biopic
老老实实按照标准操作，存液氮里面。就不会出这种问题。
兽医冬冬
我是兽医专业的，也会培养细胞，我们冻存细胞的流程一般是：收获的细胞放在细胞冻存盒里，4℃半个小时，-20℃两个小时，-80℃过夜，第二天早上放液氮。有时候也没有用细胞冻存盒，但基本没什么问题。希望可以帮到你！
AryaTST3
emmm，我师兄冻存的细胞过了有四个多月，之后贴壁生长大概花了三天才完全贴上，不过没有什么死亡的细胞。那个盒子会不会是拿出来的时候空气中的水汽凝结成冰了？
Yoda1985
1. 不同细胞在 - 80 度能存放的时间不一样，根据我的经验，皮实的细胞放半年复苏存活率也能有 80% 左右，娇贵的细胞即便 - 80 度过夜，隔天就放液氮，复苏存活率也可能只有 50%，所以别人细胞能放多久只能做个参考。
2. 答案参考问题 1 的，你的细胞能不能这么处理只有自己做预实验才能知道。
3. 这个可能是取细胞时时间太长，周围水汽凝结在你存放的盒子里，然后就积累下来了。
