先阳选磁珠分选CD4+T细胞后，下一步如何分选CD4+CD25-T细胞？

最近刚做了一次，我用的是美天旎的kit，先阴选CD4阳性细胞，再标CD25抗体，阴选出来的就是CD25阴性细胞，纯度还挺高的，一定要用它推荐的柱子，否则纯度不高

可以先MACS分选完了以后上流式分选

Biolegend公司有CD4阴选试剂盒，可以解决你这个问题。另外流式分选在多数情况下都可以很好分选想要的细胞群，但是需要多准备些细胞，分选后会死一些。

优先分选CD25+细胞，从阴选细胞中再去分选CD4+细胞

可以流式上机分选，用CD25抗体，流式分选前需要脱磁珠，可以多养两天再脱磁珠，不然细胞损耗太大，一般都跟着磁珠被分离掉了，而且细胞带磁珠的情况下最好不用太用力吹打细胞，会对细胞造成机械损伤。如果后续还需要杀伤之类，就得找好一个合适的培养时长。我一般两天

只能通过流式分选CD25-或者磁珠解离后分选了，或者通过CD25depletion抗体清除CD25阳性细胞。下次分Treg建议先阴选CD25-细胞再阳选CD4+

首先利用Cd4抗体磁珠分选出CD4+细胞，然后再用CD25+的磁珠去分选细胞，把磁柱上的CD25+细胞丢弃，收集未标记的细胞

美天旎公司有human CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit。里面的说明书非常详细，一般是先阴性分选CD4+T细胞，然后再阳性分选CD4+CD25+T细胞，另外的组分就是您所需要的CD4+CD25-T细胞。很多高水平杂志的文章都是用这个样的方法和分选策略，因为做Treg功能分析的时候同样需要用到CD4+CD25-T细胞，因此这个分选方法是有依据可循的。

分选出来CD4+T细胞，可以标记流式抗体，利用流式分选仪分选CD25-的细胞。

必须先解离CD4+细胞上面的磁珠，然后再用CD25+的磁珠去分选细胞，把分选出来的CD25+细胞丢弃，收集未被标记的细胞