磁珠分选柱手工操作分离小鼠 CD4+ CD25+ 抑制性细胞

一、实验材料

1. 小鼠

2. HBSS 洗涤缓冲液

3. MACS 缓冲液

4. CD8a（Ly-2）磁珠

5. 结合缓冲液

6. biotin-抗 CD25（7D4）

7. Streptavidin-PE

8. 抗 PE 磁珠

9. 完全 RPMI 培养基

10. 小鼠 CD3+ T 细胞富集柱和 1× 纯化柱缓冲液

11. 15ml 离心管，无菌

12. autoMACS 系统和分选柱

13. 30 mm 尼龙网或40 mm 预分离滤膜

14. 不含气体的 MACS 缓冲液，4℃（在上样和洗柱过程中保持冰冷）

15. Midi MACS 分离磁铁

16. MACS 多用支架

17. LD 分选柱

18. 15ml 离心管，无菌

19. LS 分选柱

二、实验方法

1. 用 20 只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。

2. 将细胞在 20ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

3. 将细胞悬液在 4℃，200g 离心 10 min。离心过程中，准备 3 支小鼠 CD3+ T 细胞纯化柱，按说明书的指导用 1× 纯化柱缓冲液洗 3 遍。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置一支 15ml 离心管。

4. 用 3ml 1× 纯化柱缓冲液和 3ml HBSS 洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过 30mm 尼龙网或 40mm 预分离滤膜后，每支纯化柱中加入 2ml 细胞。室温孵育 15min。

5. 用 2ml 1× 纯化柱缓冲液洗涤纯化柱 4 或 5 遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后，将细胞悬液在 4℃，200g 离心 10min。

6. 将沉淀按每 108 个细胞加 0.9ml MACS 缓冲液的比例混悬。每 108 个细胞加入 0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后 4℃ 孵育 15min。

7. 4℃，200g 离心 10min。

8. 按前述方法制备单细胞悬液，纯化 T 细胞并加入 CD8a（Ly-2）磁珠。

9. 将 Midi MACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上，并将 LD分选柱放到磁铁中，每次用 3ml 4℃ 不含气体的MACS缓冲液冲洗分选柱共 3 次。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的无菌15ml离心管。

10. 离心结束后弃上清，将沉淀用 108 个细胞/ml的 MACS 缓冲液彻底混悬。将细胞通过 30mm 尼龙网或 40mm 预分离滤膜。用 0.1-0.4ml MACS 缓冲液冲洗滤网。

11. 将细胞悬液上样到 LD 分选柱上。

12. 用 MACS 缓冲液冲洗分离柱每次 3 ml，共 3 次。第一个 3ml 应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4+ 细胞）保存。

13. 将细胞悬液在 4℃，200g 离心 10 min。

14. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到 108 个细胞/ml。每 108 个细胞加入 15mg biotin - 抗 CD25（7D4）。4℃ 孵育 15min。4℃，200g 离心 10min。

15. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到 108 个细胞/ml。每 108 个细胞加入 7.5mg Streptavidin-PE。4℃ 孵育 15min。

16. 4℃，200g 离心 10min.

17. 用 MACS 缓冲液混悬细胞使其浓度达到 108 个细胞/ml。每 108 个细胞加入 0.1 ml 抗 PE 磁珠。4℃ 孵育 15min。

18. 4℃，200g 离心 10min。

19. 按前述方案用结合缓冲液混悬细胞后加入 biotin -抗 CD25、Streptavidin-PE，以及抗PE磁珠。

20. 用 MACS 缓冲液混悬细胞使其浓度达到 108 个细胞/ml。

21. 将一支 LS 分选柱放在 Midi MACS 分离磁铁上，用 MACS 缓冲液每次 3ml 洗 3 遍 LS 柱。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的 15ml 离心管。

22. 离心结束后弃上清，将沉淀用 MACS 缓冲液彻底混悬使细胞浓度达到 108 个细胞/ml。

23. 将细胞通过 30mm 尼龙网或 40mm 预分离滤膜。用 0.1-0.4ml MACS 缓冲液冲洗滤网。

24. 将细胞悬液加到 LS 柱上。

25. 用 MACS 缓冲液冲洗分离柱每次 3 ml，共 3 次。第一个 3 ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4+ CD25- 细胞）保存。

26. 将分选柱从磁铁上取下。在分离柱中加入 5ml MACS 缓冲液。将活塞塞进分离柱并洗脱阳性细胞（CD4+ CD25+ 细胞）。

27. 将细胞在 4℃，200g 离心 10 min。将 CD25+ 细胞用 1-2 ml RPMI 完全培养基混悬。将 CD25- 细胞用 10ml RPMI 完全培养基混悬，计数。