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磁珠分选柱手工操作分离小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞

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实验材料:

1. 小鼠

2. HBSS洗涤缓冲液

3. MACS缓冲液

4. CD8a(Ly-2)磁珠

5. 结合缓冲液

6. biotin-抗CD25(7D4)

7. Streptavidin-PE

8. 抗PE磁珠

9. 完全RPMI培养基

10. 小鼠CD3+ T细胞富集柱和1×纯化柱缓冲液

11. 15ml离心管,无菌

12. autoMACS系统和分选柱

13. 30mm尼龙网或40mm预分离滤膜

14. 不含气体的MACS缓冲液,4℃(在上样和洗柱过程中保持冰冷)

15. Midi MACS分离磁铁

16. MACS多用支架

17. LD分选柱

18. 15ml离心管,无菌

19. LS分选柱

实验方法:

1. 用20只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。

2. 将细胞在20mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

3. 将细胞悬液在4℃,200g离心10min。离心过程中,准备3支小鼠CD3+ T细胞纯化柱,按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液,在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。

4. 用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后,每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。

5. 用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后,将细胞悬液在4℃,200g离心10min。

6. 将沉淀按每108 个细胞加0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108 个细胞加入0.1ml CD8a(Ly-2)磁珠后4℃孵育15min。

7. 4℃,200g离心10min。

8. 按前述方法制备单细胞悬液,纯化T细胞并加入CD8a(Ly-2)磁珠。

9. 将Midi MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上,并将LD分选柱放到磁铁中,每次用3ml 4℃不含气体的MACS缓冲液冲洗分选柱共3次。弃洗脱液,在分选柱下方放置一支新的无菌15ml离心管。

10. 离心结束后弃上清,将沉淀用108 个细胞/ml的MACS缓冲液彻底混悬。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。

11. 将细胞悬液上样到LD分选柱上。

12. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml,共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞(CD4+ 细胞)保存。

13. 将细胞悬液在4℃,200g离心10min。

14. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入15mg biotin-抗CD25(7D4)。4℃孵育15min。4℃,200g离心10min。

15. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。

16. 4℃,200g离心10min.

17. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。

18. 4℃,200g离心10min。

19. 按前述方案用结合缓冲液混悬细胞后加入biotin-抗CD25、Streptavidin-PE,以及抗PE磁珠。

20. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。

21. 将一支LS分选柱放在Midi MACS分离磁铁上,用MACS缓冲液每次3ml洗3遍LS柱。弃洗脱液,在分选柱下方放置一支新的15ml离心管。

22. 离心结束后弃上清,将沉淀用MACS缓冲液彻底混悬使细胞浓度达到108 个细胞/ml。

23. 将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。

24. 将细胞悬液加到LS柱上。

25. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml,共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞(CD4+ CD25- 细胞)保存。

26. 将分选柱从磁铁上取下。在分离柱中加入5ml MACS缓冲液。将活塞塞进分离柱并洗脱阳性细胞(CD4+ CD25+ 细胞)。

27. 将细胞在4℃,200g离心10min。将CD25+ 细胞用1-2ml RPMI完全培养基混悬。将CD25- 细胞用10ml RPMI完全培养基混悬。计数。

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