AUTOMACS系统自动分选体系分选小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞

实验材料：

1. 小鼠

2. HBSS洗涤缓冲液

3. MACS缓冲液

4. CD8a（Ly-2）磁珠

5. 结合缓冲液

6. biotin-抗CD25（7D4）

7. Streptavidin-PE

8. 抗PE磁珠

9. 完全RPMI培养基

10. 小鼠CD3+ T细胞富集柱和1×纯化柱缓冲液

11. 15ml离心管，无菌

12. autoMACS系统和分选柱

实验方法：

1. 用20只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。

2. 将细胞在20mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

3. 将细胞悬液在4℃，200g离心10min。离心过程中，准备3支小鼠CD3+ T细胞纯化柱，按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。

4. 用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后，每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。

5. 用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后，将细胞悬液在4℃，200g离心10min。

6. 将沉淀按每108 个细胞加0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108 个细胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。

7. 4℃，200g离心10min。

8. 以MACS缓冲液混悬细胞，使细胞浓度达到108 个细胞/ml。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。将细胞放到autoMACS的上样通道。选择depletes程序（CD4+ T细胞将从阴性通道洗脱。

9. 回收细胞计数，在4℃，200g离心10min。

10. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g离心10min。

11. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。

12. 4℃，200g离心10min.

13. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。

14. 4℃，200g离心10min。