大分子量蛋白200kDa，在做western blot要注意什么

注意以下问题：1、 缓冲液中加甲醇的作用是使SDS游离出来，并增加膜结合蛋白的量，但过多的甲醇会使胶收缩，造成大分子在凝胶中的沉淀而降低转膜效率。大分子量的蛋白质（如大于60kDa）应使用低浓度的甲醇或不使用甲醇。

2、 电转移效果检查方法：①考马斯亮兰染色电转移后的凝胶，检查是否还有蛋白质存留；②丽春红染色，检查膜是否吸附了蛋白质。

3、 湿式电转方法效率高，半干式电转方法转移速度较快。

4、 阻断剂有BSA、Tween-20、脱脂奶粉和其他动物的血清等多种，阻断的效果不尽相同，如果实验中发现背景过高，可以尝试更换阻断剂。

5、 一抗和酶标二抗的浓度十分重要，浓度过高，造成背景过高；浓度过低造成灵敏度偏低，实验中应根据一抗和酶标二抗的效价，对此参数进行优化。此外，一抗的质量十分关键，抗体特异性和效价直接影响实验结果。

6、 须严格控制假阳性反应，可使用免疫前血清作为阴性对照，同时要以抗原作为绝对的阳性对照，准确确定阳性条带的位置。

在进行 Western blot 实验时，对于大分子量蛋白（如200 kDa）的检测需要特别注意以下几点：

蛋白质的迁移：由于大分子量蛋白分子较大，迁移速度较慢。为了充分迁移，需要增加电泳时间、电压或使用缓冲液含有特殊的离子浓度梯度。

蛋白质的转移：大分子量蛋白转移至膜上的效率可能较低，因此需要更长的转移时间和更高的电流来促进转移。

膜的选择：选择适合大分子量蛋白检测的膜。例如，PVDF（聚偏氟乙烯）膜比NC（硝酸纤维素）膜更适合检测大分子量蛋白。

抗体的选择：使用适合大分子量蛋白的抗体。一般来说，多克隆抗体更适合大分子量蛋白检测。

电泳和转移条件的优化：针对特定的蛋白质和条件，可以通过优化电泳和转移条件来提高大分子量蛋白的检测效果。

质量控制：在进行实验前，需要对蛋白质样品的纯度和浓度进行检测，并尽可能避免样品的降解或污染。

总之，对于大分子量蛋白的检测，需要特别注意电泳和转移条件的优化、膜和抗体的选择，以及样品质量的控制，以保证实验的准确性和可重复性。

用较低浓度的page胶比如8%的分离胶，转膜条件可以按照90V恒压3h