sswei
注意以下问题:1、 缓冲液中加甲醇的作用是使SDS游离出来,并增加膜结合蛋白的量,但过多的甲醇会使胶收缩,造成大分子在凝胶中的沉淀而降低转膜效率。大分子量的蛋白质(如大于60kDa)应使用低浓度的甲醇或不使用甲醇。
2、 电转移效果检查方法:①考马斯亮兰染色电转移后的凝胶,检查是否还有蛋白质存留;②丽春红染色,检查膜是否吸附了蛋白质。
3、 湿式电转方法效率高,半干式电转方法转移速度较快。
4、 阻断剂有BSA、Tween-20、脱脂奶粉和其他动物的血清等多种,阻断的效果不尽相同,如果实验中发现背景过高,可以尝试更换阻断剂。
5、 一抗和酶标二抗的浓度十分重要,浓度过高,造成背景过高;浓度过低造成灵敏度偏低,实验中应根据一抗和酶标二抗的效价,对此参数进行优化。此外,一抗的质量十分关键,抗体特异性和效价直接影响实验结果。
6、 须严格控制假阳性反应,可使用免疫前血清作为阴性对照,同时要以抗原作为绝对的阳性对照,准确确定阳性条带的位置。
loveliufudan
在进行 Western blot 实验时,对于大分子量蛋白(如200 kDa)的检测需要特别注意以下几点:
蛋白质的迁移:由于大分子量蛋白分子较大,迁移速度较慢。为了充分迁移,需要增加电泳时间、电压或使用缓冲液含有特殊的离子浓度梯度。
蛋白质的转移:大分子量蛋白转移至膜上的效率可能较低,因此需要更长的转移时间和更高的电流来促进转移。
膜的选择:选择适合大分子量蛋白检测的膜。例如,PVDF(聚偏氟乙烯)膜比NC(硝酸纤维素)膜更适合检测大分子量蛋白。
抗体的选择:使用适合大分子量蛋白的抗体。一般来说,多克隆抗体更适合大分子量蛋白检测。
电泳和转移条件的优化:针对特定的蛋白质和条件,可以通过优化电泳和转移条件来提高大分子量蛋白的检测效果。
质量控制:在进行实验前,需要对蛋白质样品的纯度和浓度进行检测,并尽可能避免样品的降解或污染。
总之,对于大分子量蛋白的检测,需要特别注意电泳和转移条件的优化、膜和抗体的选择,以及样品质量的控制,以保证实验的准确性和可重复性。
balalaLy
用较低浓度的page胶比如8%的分离胶,转膜条件可以按照90V恒压3h
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