有关提取细胞蛋白做western blot的若干问题

DXY网友sunyuxiaoxi提问：细胞状态很好，想尽快做western blot。但是存在以下问题：我要在培养的细胞中注射一种药物，观察此药物作用不同时间下我要检测的指标的变化。我取的时间点是：注射药物后10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h。能否待我把各时间点的细胞都收集好了，再统一加细胞裂解液，然后测蛋白？

但我所在实验室的有些同学说：不可以，必须是收集完细胞后马上加裂解液，然后测蛋白，但是如果这样做的话，对于我来说，实验过程相当麻烦，6个时间点分开测蛋白的话一肯定测不完，这样肯定会对我要提取的蛋白有不良的影响；还有些同学说，可以先用胰酶消化细胞，然后离心，接着暂时放4℃冰箱保存，带所有时间点的细胞都消化病离心完后，再同意加裂解液和测蛋白，不知这种方法可以吗？

DXY网友DXY721回复：第二种方法可行。加药干预规定的时间，然后用PBS洗净，胰酶消化，收集细胞，4 ℃保存，如果时间长就-70 ℃保存，然后一起裂解提蛋白。

DXY网友sandy99回复： 裂解液加完后，收集液体，可保存于-20 ℃一段时间。因为有时为了裂解完全，还要反复冻融。这样，可以得到各个时间点的蛋白都收完，再做离心和蛋白定量。希望对楼主有帮助。

楼主提问：收集的液体是否还要经过离心才能放-20 ℃保存?

DXY网友DXY721回复：磷酸化是一个很迅速的过程，只要能保证细胞加药后发生磷酸化然后“停留”在磷酸化这个点上就可以了，不然抓不住磷酸化的瞬间就不好测了。我做的就是磷酸化WB，我是加药后孵育10 min立即用预冷PBS洗去药物，然后冰上操作裂解细胞，裂解液也是预冷的，整个过程速℃要快。加了裂解液冰上吹打30 min，然后4 ℃14000转离心30 min，取上清，加sample buffer煮沸10 min，-70 ℃保存长时间保存，如果短期内做可以-20保存。这就是我的磷酸化蛋白处理过程，供参考。我不是很赞同sandy99战友的“反复冻融”的观点，个人认为这样蛋白容易降解。

DXY网友syo820924回复：DXY721 的意见不错，我在做磷酸化AKT，也是处理2 min后立即要收细胞，我是倒掉培养液后直接加裂解液到培养瓶然后用细胞刮刮下来然后在冰上裂解30 min.关于sunyuxiaoxi 的问题，我觉得还先把蛋白提出来放-80℃比较合适，这样对实验结果的影响会小些吧。