动物组织如何提取高纯度rna

RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取动物RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。

异硫氰酸胍法（PLT ）

1. 取新鲜动物组织0.1 ～0.2g 置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml, 在冰浴中迅速匀浆15 ～30s ，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2. 加入2mol 醋酸钠（pH4.0 ）120 μl ，充分混匀。

3. 加入1.2ml 酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s ，冰浴15min 。

4. 将混合物转移至1.5ml Ep 管中，4 ℃，离心10 000r/min,20min.

5. 移取上层水相至另一Ep 管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20 ℃，30min 沉淀RNA.

6. 4℃ ，离心12 000r/min ，15min.

7. 弃上清液，加入70% 乙醇400 μl, 洗涤RNA 沉淀物；如果RNA 沉淀物被悬浮，则4 ℃离心10 000r/min ，10min 。

8. 弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA 难以溶解。

9. 加入100 μl 无RNase 水重悬RNA ，或加1ml 无水乙醇和1/10 体积3mol 醋酸钠（pH4.0 ），?C70 ℃保存。

用专用的RNA提取试剂盒，如果用Trizol法的话在后面清洗过程中多洗1～2遍。

可用Trizol法提取高纯度RNA

1、将组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml的Trizol液研磨；每2E6个细胞加入1mLTrizol.注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%.

2、研磨液室温放置5min,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,静置5min,12,000rpm离心5min.

3、取上层水相于一新的离心管,按每1ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,剧烈振摇使混匀,4℃,12,000rpm离心10min.

4、弃去上清液,按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入70%乙醇,涡旋混匀 ,4℃×7,500rpm×5min.

5、重复以上步骤.

6、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10min,加入30μL RNase Free的水中.

7、电泳检测.