RNA提取，rtPCR和qPCR碰到的问题

firekirin

2021-11-17

各位前辈好，本人初入此门，仍在不断学习，遇到些问题，也曾google，不得要领，来此求助，希望前辈不吝赐教。万分感谢。 RNA提取（Trizol法） 1. 主动脉中提取RNA，使用液氮研磨，在加入下一个标本前，如何清洁研磨？ 2. 有何办法尽量多取到组织粉末？ 3. 实验室里也有SPEX的液氮冷冻研磨机，但感觉不好用，组织标本粘在小管壁上，不磨碎，也取不出，有用过这种机器的前辈请指教。 4. 提取的RNA浓度，各标本间差异大，少的10几ng/ml，多的100ng/ml，低浓度的标本反而260/280的值更高到1.80，高浓度的在1.60，这会影响后面的rtPCR吗？如何处理呢？。 rtPCR 5. 我没有把RNA调到相同浓度就做了逆转录成cDNA，要继续做qPCR，可以参照RNA的浓度稀释cDNA吗？ qPCR 6. 做qPCR同时，会做housekeeping gene，想看某药物对基因的调节作用，如果该药物也影响housekeeping gene，是不是实验结果就会很混乱？也许问题比较多，也比较幼稚，还请包涵，再谢了：）

2 个回答

wangqing2020

2021-11-17

有帮助

取完一个标本后，趁研钵还是很冷的状态下，向研钵中加一勺（用不锈钢的小汤勺即可）液氮，立刻用研棒搅动样品，趁样品飘在液氮中，将样品和液氮一起倒到锡箔纸做成的小碗中（用来收集废样，便于丢弃）。如果一次洗不干净，可以多洗两遍，我都是这样做的，一般洗两次就很干净了。

wangqing2020

2021-11-17

有帮助

1、用液氮冲洗一下，没有上一个标本的残留就可以了。 2、用小药匙取粉末很方便。需要先将小药匙在180度烘6小时以上，用时在液氮中预冷。 3、曾经试用过液氮冷冻研磨机，发现不如研钵好用，一是大部分组织样品磨不碎，二是大部分组织粘在了管壁上，很浪费。 4、自我感觉260/280的值在1.6-1.9之间都没问题，可以直接往下做。 5、cDNA可以不用稀释，因为有内参，模板多，内参值就会大；模板少，内参值就小，结果是一样的。 6、可以预先多选几个housekeeping gene做个小实验，挑选1个不受该药物影响的housekeeping gene做为qPCR的内参就可以了。