天一湖医者
两步法是只有循环中只有“变性”—“退火延展”两个温度变化
三步法是“变性”—“退火”—“延展”三个温度变化
简单说两步法就是2个温度循环
三步法就是3个温度循环
用两步法快些,但要看酶活性,
三步法比较保险。
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对定量pcr来说:因为产物是短片段,用两步法或三步法影响不大。
两步法即循环扩增中设置2个步骤,一个是95度变性,另一个是退火与扩增的温度,一般设置在55~60之间,主要用于扩增短片断,节省时间。
三步法就是平常见到的方法,扩增分三步,变性,退火,延伸。时间稍长。
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二步法三步法区别:
1、步骤不同:两步法退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,而三步法则分两次完成。
2、用时不同:两步法减少一次升降温过程,提高了反应速度,用时较短。而三步法则比两步法用时更长。
3、适用条件不同:两步法中,PCR扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成。三步法的PCR扩增区则较长,需要降低系统温度,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
对结果影响不大,但如果你想得到更加严谨的数据,三步法用于定量pcr是更准确的
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