SP三步法操作指南（原创）

一、实验原理与意义

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。SP(streptavidin-perosidase)法，即链霉菌亲和素-过氧化物酶法，按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌亲和素-过氧化物酶（SP）法等，其中SP法因为灵敏度高、背景低等优点，是目前免疫组化首选方法之一。

二、实验器材

微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制

1、0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4•2H2O＋58.02 g Na2HPO4•12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4•2H2O：15.6 g in 500 ml dH2O；B. 0.2 M Na2HPO4•12H2O ：71.632 g in 1000 ml dH2O）。

2、Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml dH2O（A.柠檬酸：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.柠檬酸钠：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。

3、细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul Triton X-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30%H2O2。

4、5%羊血清或封闭血清，用PBS稀释。

5、含0.03%H2O2的0.05%DAB（避光）：用20×DAB（1%，10 mg/ml）5 ul+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。

6、一抗用PBS稀释（也可用抗体稀释液），二抗用中杉金桥的SP染色试剂盒。

7、Xylene、梯度Ethanol（100%×2、95%、80%、70%、50%）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。

8、苏木素染液。

四、操作步骤：

1、脱蜡：60℃ 20min；二甲苯I10min 、二甲苯II10min。

2、梯度酒精脱水：100%EtOH I 5min 、100%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。

3、灭活内源性过氧化物酶：3%H₂O₂ 常温下避光孵育10min，PBS冲洗3次×3min；

4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（微波炉可高火4次×6min），自然冷却30min 以上，至室温后PBS冲洗3次×3min。

5、封闭：用封闭液（一般与二抗来源一致，如正常羊血清工作液）封闭，常温下10~30min，倾去勿洗。

6、一抗孵育：滴加适宜浓度的一抗4℃ 冰箱孵育过夜（最常用），37℃复温45min，PBS冲洗5次×3min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；

7、二抗孵育：滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min, PBS冲洗5次×3min；

8、SP反应：滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗5次×3min；

9、DAB显色：配置DAB/H₂O₂反应液孵育组织切片，镜下控制染色，一般3~10min，自来水充分冲洗；

10、苏木素复染：一般胞浆蛋白或胞膜蛋白可以适当染至几十秒~几分钟，但细胞核蛋白在几秒。若过染，可以用1%HCl褪色；

11、常规脱水：50% ethanol 1-2min、70% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、100% absolute ethanol: （1-2）min、100% absolute ethanol: （1-2）min；

12、透明：Xylene 1×（1-2）min→Xylene 2×（1-2）min；

13、封片：中性树胶。

五、注意事项

1、苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。

2、DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

3、抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度过夜。

4、切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。