SP三步法操作指南（原创）

一、实验原理与意义

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。SP(streptavidin-perosidase)法，即链霉菌亲和素-过氧化物酶法，按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌亲和素-过氧化物酶（SP）法等，其中SP法因为灵敏度高、背景低等优点，是目前免疫组化首选方法之一。

二、实验器材

微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制

1、0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4•2H2O＋58.02 g Na2HPO4•12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4•2H2O：15.6 g in 500 ml dH2O；B. 0.2 M Na2HPO4•12H2O ：71.632 g in 1000 ml dH2O）。

2、Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml dH2O（A.柠檬酸：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.柠檬酸钠：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。

3、细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul Triton X-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30%H2O2。

4、5%羊血清或封闭血清，用PBS稀释。

5、含0.03%H2O2的0.05%DAB（避光）：用20×DAB（1%，10 mg/ml）5 ul+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。

6、一抗用PBS稀释（也可用抗体稀释液），二抗用中杉金桥的SP染色试剂盒。

7、Xylene、梯度Ethanol（100%×2、95%、80%、70%、50%）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。

8、苏木素染液。