实时定量PCR应用中的问题

实时定量PCR已广泛地运用于分子生物学的各个领域，就目前的应用情况来看，虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是争论不休的，本文将就这些问题做出探讨。

1. 方法的选择 ：研究者在实验中往往想要得到目的基因的绝对量，因为绝对定量对目的基因的表达差异有直接的反映[38]。绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法，用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA[39]。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进行扩增，使用的荧光材料可以是杂交探针、水解探针或是SYBR Green I。有研究表明[40]，这一方法的动力学范围可以达到9个数量级，远比终点法的要高。这一方法虽然简便，但是为了得到可靠的实验结果，有两个先决条件必须等到满足，一是所选用的标准品必须与目的基因的扩增效率一致，要达到这个要求，需要标准品同目的基因的同源性尽可能的高，不仅长度相似，而且其碱基组成也尽量相同；二是要尽可能地优化实验条件和模板的准备过程。就标准品而言，实践中有外参照和内参照之分，作为外参照的标准品与目的基因不在同一反应体系中进行扩增，所以它无法检测也不可能补偿可能出现在目的基因反应体系中的影响因素，如PCR抑制子[41]。事实上，在绝大多数的实验中，要想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的。为了弥补单独使用一个标准品作为外参照的不足，研究者便引入一个内参照同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR。竞争性PCR 所使用的内参照具有与目的基因序列相同的引物结合位点，但不具有相同的探针结合位点[42]。关于内参照的设计，有多种方法可供选择，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突变[43]，改变目的基因中的某些核苷酸[44]，设计不同的限制性酶识别位点[45]，也可以用非特异的间隔基因或间隔DNA 作为内参照[46]。竞争性PCR 设计的原理在于内参照与目的基因相互竞争反应的原料，所以两者的量应当相互匹配，如果一方的拷贝数大大的高于另一方，那么拷贝数多的一方就会在反应体系中得到优先扩增，而拷贝数少的一方则扩增受到抑制，定量也就不能有效地进行。由于使用了内对照，所以一旦体系中存在干扰PCR扩增的因素，就会通过内对照的扩增效率的变化反映出来，目前使用的实时定量PCR仪都是以扩增曲线上crossing point的漂移来体现扩增效率的变化的。竞争性PCR 由于能够消除反应体系中干扰因素的影响，所以它所等到的结果要准确可靠得多，但是由于在反应体系中同时扩增两种模板，使得其结果的测定范围比单使用外参要大为缩小，往往只有2-3个数量级[40]。正是由于竞争性PCR 有利有辟，所以研究者应根据不同的情况决定是否使用内参照。
在目前的研究中，大多数研究者选择使用绝对定量的方法，但是也有学者[47]认为在当前的条件下，绝对定量具有难以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀释浓度的标准品不仅费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。（2）标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。（3）每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时PCR 的高通量有所降低。（4）由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。鉴于以上原因，这些学者强烈地推荐使用相对定量的方法，所谓相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷贝数的比较；（2）作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；（3）标准化标本[47]。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以以管家基因的定量来作为某种标准以比较样本来源不同的目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根据具体的需要而选定合适的管家基因。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因的同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。除了这种常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]设计了一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达，他们根据数学推导得出目的基因的量=2-^^Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照，所以，2-^^Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，所以这一方法更为简便省时。统计学结果表明这一方法的结果也是相当可靠的。
总之，相对定量不仅比绝对定量更加简单，经济（如果不做标准曲线），而且也更为可靠和准确，因为存在于反应体系中的干扰因素，如样本不纯、试剂影响等都可以通过数学处理而去除。
2. 重复性问题 ：重复性是判断实验结果优劣的重要指标，其主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV）。对于特定的分析系统，重复性的高低决定了PCR反应能检测出样本中目的基因的初始浓度变化的最小值。由于PCR反应本身具有不精确扩增的特性，它所造成的结果精确性要远小于经典的临床化学检验和免疫分析。对于绝大多数实验，一般都可以计算出所设计体系能检测出样本初始浓度的最小值，根据多次实验可以求得该最小值的变异情况和它的可信区间范围，变异越小或是可信区间范围越小，说明这一反应体系的精确度越高。在实时定量PCR过程中，从样本的准备到扩增，再到定量的进行，实验中的每个方面都与实验的重复性息息相关，除了加样的准确性和实验所选用的仪器固定参数的限制之外，影响结果重复性较为关键的因素还包括（1）PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。（2）目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。（3）标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。
3. 敏感度问题：实时定量PCR 由于使用了荧光物质作为定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]报导实时定量PCR 的敏感性要高出传统的终点定量PCR 大约250倍。在理论上，只要设计的引物对目的基因有足够的特异性，PCR 应可检测出只含一个拷贝目的基因的样本，也的确有人报导在特定的反应条件下，实时定量PCR 可以检测出单细胞水平的基因组DNA[11]，但是在大多数情况下，对基因组DNA而言，它的最低检出限一般在pg到fg级，对于病毒、质粒而言，其检出限一般在102-103拷贝数以上[8]。影响实时定量PCR 敏感性的因素众多，除了对一般PCR反应均存在的影响因素如反应体系、Taq酶的活性之外,实时定量PCR还有其特殊的影响因素，包括：
(1)反应体系中形成的引物二聚体的影响：引物二聚体是非特异性退火和延伸的产物,它的形成不仅会影响到扩增的效率,而且由于SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合,所以会在反应体系中出现特异性产物与引物二聚体竞争SYBR Green I的现象,从而降低了实时PCR的敏感性。要解决这个问题，有多种方案可供选择，首先可以用水解探针代替SYBR Green I，虽然水解探针并不能消除引物二聚体的形成，但是在定量检测时，它却可以避开引物二聚体的干扰，专一地测定来自于特异产物的荧光信号，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用热启动办法，所谓热启动是指在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体的是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成，另外Lightcycler提供一种Taq酶的抗体，在PCR反应的最初阶段，这种抗体能阻断Taq酶的作用，但是当反应温度达到70度时，它便失活，使Taq酶开始发挥作用，在反应体系中加入这一抗体的目的也就是使要在反应达到较高温度时，才开始PCR扩增，从而避免反应初始阶段引物二聚体的形成。第三，要尽可能地优化引物设计，例如所设计的两条引物不能互补（尤其在3’端），使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等，这些都是防止引物二聚体形成的根本因素。第四，如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。最后，在实验过程中应当注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。
（2）循环数：一般的实时定量PCR反应只须25－30个循环便可获得满意的结果，但是对于那些极微量的待测样本而言，适当增加循环数可以提高反应的检出限，有文献报导当循环数从25增加到34个循环时，实时定量PCR的最低检出限可从106增加到103。但是并非循环数增加得越多，其敏感性就会越高，实际上，当循环数增加到某一值时，敏感性便不再升高，因为循环数并不是影响敏感性的唯一因素，而且在实验过程中，也不可能因为增加敏感性而无限制地增加循环数，这不仅是实践中行不通，而且在理论上也不可行，因为随着循环数的增加，一方面，聚积的产物会抑制Taq酶的活性，另一方面，也会增加形成异源二聚体的可能性，这些都会影响到最终的定量结果。
（3）Mg2＋的浓度：根据Roche公司的Lightcycler3.5版本技术说明，Mg2 的浓度将影响到实时定量PCR的敏感性，其推荐使用的浓度为3mM。Mg2 浓度对敏感性的影响主要存在于两方面，首先，Mg2 是影响Taq酶活性的关键因素，如果Mg2 的浓度无法达到使Taq酶发挥最佳活性，无疑将会影响到实时定量的敏感性；其次，Mg2 的浓度过高，会增加引物二聚体的形成，从而导致敏感性降低。所以在反应中选择合适的Mg2 浓度条件，是相当重要的。