微卫星PCR在动物分类和进化中的应用

微卫星 PCR 是对由 2〜6 个碱基重复排列而形成的微卫星 DNA，利用保守序列设计引物进行 PCR 扩增，因重复单位数目的差异而呈现多态性。

微卫星 PCR 在动物分类和进化中的应用的基本原理是利用微卫星 DNA 研究动物遗传特性的主要过程是：选取该物种的微卫星位点；设计引物进行 PCR 扩增，分析扩增结果，筛选出其中扩增效率高、多态性良好、适于遗传检测的微卫星位点，分析该品系动物的遗传特性。

其中获得微卫星位点的方法主要有两种：一是数据库法，这是最方便、经济的方法。可以从已经发表的文献或公共的 DNA 序列数据库，如 GenBank、Europe Molecular Biology Laboratory(EMBL)、DNA Data Bank of Japan(DDBJ) 中查找所要研究物种的微卫星位点和引物, 另外基因组表达序列标签 (expressed sequence tags,EST) 数据库中也有大量的微卫星位点可供筛选使用。

同时，由于近缘物种间的序列相似性高，从一个物种筛选设计的特异性引物有时也能用于研究其它近缘物种，从而大大提高了微卫星研究的效率二是自筛法。对于许多稀有物种，需要自己设计引物, 筛选位点。

基本步骤：

① 提取所要研究物种的基因组 DNA；

② 使用限制性内切酶，将基因组 DNA 切割成均匀的小片段；

③ 凝胶电泳，回收大小约 300〜500 bp 的片段；

④ 将回收片段克隆放大，使用标记探针进行杂交；

⑤ 筛选出含有重复序列的克隆，测序证实重复序列片段的存在；

⑥ 在重复序列片段两端区域设计引物对，进行 PCR 扩增，检验引物的有效性；

⑦ 小量样本进行预试验，挑选出重复性好、具多态性的微卫星位点。

微卫星 PCR 在动物分类和进化中的常用应用领域如下：

1、遗传分析

徐玲玲等从资料和 GenBank 中选取了扩增效果好、等位基因多、均匀分布于小型的猪 18 条常染色体和 X 性染色体上的 100 个微卫星位点，合成引物，对封闭群小型的基因组进行 PCR 扩增及条件优化，从中筛选出 32 个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点，应用于封闭群小型猪的遗传检测。李瑞生等选取大鼠 7 条染色体上的 9 个微卫星位点合成了 10 对引物，对国内北京和哈尔滨等 4 家单位提供的 6 个品系 (SHR、SHRSP、LEW、RCS、WKY 和 F344) 的 8 个近交系大鼠群体进行了 DNA 多态性分析的研究。

结果表明 9 个微卫星位点具有显著多态性；不同品系个体之间具有多态性；同一群体不同个体之间除 SHR(哈尔滨) 的 SMST 位点和 WKY(哈尔滨) 的 AGT 位点出现一定的差异外，其它均没有差异；不同地区同一品系的不同个体之间也存在一定的差异。该方法能有效地对近交系与杂交系、品系与品系、品系与亚系加以区分。为开展近交系大鼠遗传作图、基因定位和为实验动物的遗传背景监测提供可靠的信息，为大鼠遗传基因的研究提供了一个快捷简便、特异准确的方法。

2、亲缘关系的鉴定

Innocentiis 等利用 4 个高多态性的微卫星标记对意大利金头鯛 (Spaus auratus) 的两个养殖群体 BR1 的 39 尾个体和 BR2 的 59 尾个体进行了遗传分析，结果表明 BR2 群体，分别来自于 5 个野生群体，而且其所占的百分比相差不大 (10.3%〜27.6%)；BR1 群体中的大部分 (43.6%) 个体来自于大西洋种群，剩下的来自于伊特鲁里亚海 (20.5%) 和撒丁运河 (20.5%)。

器材：

PCR 仪、离心机、电泳仪

试剂：

① Taq DNA 聚合酶

② dNTP

③ 10 × PCR 缓冲液

④ DNA marker

⑤ 丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺 (19:1)

⑥ 尿素

⑦ 过硫酸铵

⑧ TEMED

⑨10% 乙酸

⑩ 硝酸银

⑪ 甲醛

⑫ 无水碳酸钠

⑬ 硫代硫酸钠

微卫星 PCR 在动物分类和进化中的应用的基本过程可分为如下几步：

1、基因组 DNA 的分离和定量

常规酚-氯仿法提取动物 DNA 样本，用紫外分光光度计测量 OD260/OD280 值确定纯度，将样本稀释至 50 ng/μl 作为 DNA 模板，4 ℃ 保存备用。

2、微卫星位点的选择

根据 DNA 数据库和已有文献，选取等位基因多、核心序列重复率高的微卫星位点，同时兼顾生化标记分析位点所在的染色体。

3、PCR 反应体系

反应体系为 25 μl, 其中含：

① 10 × 缓冲液 2.5 μl；

② 25 mmol/L MgCl2：分成 0.5 μl、1.0 uI、1.5 μl、2.0 uI、2.5 μl、3.0 μl 6 个梯度；

③ 2 mmol/L dNTP 1 μl；

④ 50 umol/L 上游引物 0.25 μl；

⑤ 50 μmol/L 下游引物 0.25 μl；

⑥ 样品 DNA 0.5 μl；

⑦ Taq 酶 1 U，最后用灭菌水补足。

4、PCR 反应条件

95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃ 变性 1 min；退火设 50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃、65 ℃ 共 6 个梯度（由 PCR 仪一次设定）1 min；72 ℃ 延伸 1 min；设定 30 个循环；最后 72 ℃ 延长 5 min。

5、PCR 结果的分析

（1）琼脂糖凝胶电泳：将所有位点扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳后条带清晰，只有一条或两条，且条带大小位于 50~350 bp 范围内的位点作为被选位点，进而优化反应体系的 Mg2⁺ 浓度和退火温度，再通过琼脂糖凝胶电泳结果初步判断位点的多态性，将等位基因数大于 3 个的位点保留，淘汰其它位点。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：对琼脂糖凝胶电泳初筛得到的 PCR 扩增产物，取 6 μl 于 8% 的聚丙烯酰胺凝胶，100 V 电泳 1.5 h, 银染，拍照。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳图像结果，运用 BIOProfile Programe 初步统计分析，得到各个位点的等位基因数目。

（3）银染检测方法：凝胶于固定液中固定 20 min, 漂洗干净后进行硝酸银溶液染色 30 min，再漂洗后，于显色液中显色，条带清晰后用 10% 乙酸溶液终止显影，干燥后进行检测。

（4）结果判读：根据聚丙烯酰胺凝胶上 DNA 条带泳动距离进行结果判读，泳动距离最长的带设定英文字母 a，依次为 b、c、… 如果不同品系动物 DNA 条带泳动距离一致的，即表现为单态性，若有差异即为多态性。统计不同品系在研究位点上表现出多态性带的数目，扩增结果按 Lynch 法计算相似系数 F = 2Nab /（Na+Nb），其中 Nab 为两个品系相同谱带数；Na，Nb 为二者分别扩增带数，若无扩增带记为「—」。

1、模板

DNA 模板的用量在 25~100 ng（25 μl 体系）均可获得较好的扩增条带，其中以 50ng 模板较适宜中。另外，小片段模板 DNA 的扩增效率通常优于大片段 DNA。因此，有建议认为，在 PCR 反应前采用机械剪切或用稀有限制内切酶消化基因组 DNA 更为有利。

2、Mg2⁺ 浓度

Mg2+浓度是影响扩增效果的主要因素之一。对于微卫星 PCR 反应体系，MgCl2 的浓度通常以 1.5 mmol/L 左右为宜。但对于不同引物和模板，需要设计不同梯度进行优化，方可取得理想结果。

3、退火温度

退火温度对微卫星 PCR 反应的影响较大。在以寻找基因差异为目的的实验中，退火温度降低，效果较好。