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求助!同源重组构建质粒连不上,求助各位大佬帮忙分析改进一下!!!

相关实验:质粒构建技术

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载体片段10000bp,目的基因片段2058bp,使用了诺唯赞的同源重组酶C112,无论各种比例各种条件都试了,均没有单菌落,偶尔有长单菌落,菌p显示假阳性无条带。能确定载体酶切肯定是切开了。

考虑是否基因太长不好连接,将目的基因进行分段连接,用了诺唯赞C117,还是连接不上。

后来分析了目的基因的结构域,p了一段138bp的片段,还是连不上。

现在已经不知道如何改进条件了,有没有大佬可以帮忙看看是怎么回事,万分感谢!!!!

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