大分子片段构建载体总是不成功

考虑以下问题：

（1）buffer和酶切效率。

同样受到内切酶的活力及buffer影响，值得注意的是不同厂家的内切酶一般匹配不同的buffer，所以在设计酶切引物时就应该优先核对buffer问题，同一厂家使用同一种buffer的两种酶酶切时可以同时加入两种酶进行酶切，节省实验时间，同时酶切效率会有所提高。

（2）内切酶受到甲基化等因素影响

一些限制性内切酶的酶切效率受到甲基化的影响，如MluI受GC甲基化的影响。甲基化是指在真核生物中普遍存在对特定序列进行甲基化修饰的现象，保证了遗传物质的稳定性。在我们平常使用的载体可能通过感受态扩繁后提取，用于酶切连接，此时要注意我们使用的感受态类型，如常用的Dh5a等都会对遗传物质进行甲基化修饰，使得受甲基化影响的内切酶活力降低，酶切效果不佳。

解决：排除内切酶的影响，可以通过重新筛选酶切位点和酶来尝试有无改善，同时也可以更换不同产家内切酶进行尝试，个人觉得NEB的酶比较好用，效率也较高（请NEB联系我协商广告费用的问题QAQ!）。另外，甲基化修饰的感受态可以购买甲基化缺陷型感受态细胞（如JM110），将载体重新转化扩繁提取质粒，这样就使排除了甲基化的干扰。

选酶时一定要认真看说明书，再设计实验。

可以提完质粒先跑个胶或者做个酶切跑胶，看下判断大小，判断是否真的构建成功

考虑是pcr显影的问题，换一台pcr机器吧

可能有以下问题存在:

1.引物，PCR是基于引物来实现的。引物是否是自己设计的？如果是，需要检查一下引物设计的是否合理。如果是从文献中选取的，一般出问题的可能性不大，不放心的可以在数据库比对一下，防止文献出错。

2.模板，一般来讲通过试剂盒提取的DNA质量都是可以保证的，也能在4℃冰箱放置较长的时间，仍能进行PCR扩增。要是通过煮沸法粗提的DNA就没办法放置太长时间了。一句话就是，模板DNA的浓度要合适。

3.反应条件，这一块就比较复杂了，特别是对自己设计的引物来说，选择合适的退火温度，是需要慢慢摸索的，一般根据计算的退火温度降低5~10℃来进行首chi扩增，如果出现了目的条带，且有杂带时，在逐步提高退火温度，以提高反应的特异性。

此外，还有反应体系，电泳条件等等因素。

这种情况可能存在多种可能性，以下是几个可能导致该问题的原因和建议：

质粒提取问题：可能您的质粒提取方式不正确，导致在PCR反应中所使用的质粒质量不够，或者存在一些抑制PCR反应的物质。建议您使用更加可靠的质粒提取方法，如商业化质粒提取试剂盒等，并注意使用纯净的水或缓冲液溶解提取的质粒。

菌液质量问题：菌液PCR的成功率通常取决于菌液的质量，如果菌落没有正确生长或者菌落生长过程中受到了一些不可避免的干扰，可能会导致菌液PCR失败。建议您检查您的菌落生长条件，并注意采取一些有效的方法来提高菌液的质量。

PCR反应条件问题：菌液PCR的反应条件和扩增片段的大小有关，可能您需要调整PCR反应的条件，例如增加反应时间、改变PCR循环的次数、降低扩增片段的温度等。此外，可能需要优化PCR反应的引物浓度、模板DNA浓度等反应参数，以提高扩增的成功率。

质量控制问题：最后，建议您进行质量控制。可能需要对扩增产物进行质量鉴定，例如进行限制性内切酶酶切或测序等方法，以确保扩增产物的正确性和纯度。