4kb载体与3kb片段连接一直不长菌落

各位老师好，最近做无缝克隆一直不成功，具体过程如下，求指教。

载体4234bp；目的片段3513bp

①载体线性化（50ul体系）

载体（600ng/ul）2ul，

EcoR I 0.75ul，Xho I 0.75ul，

10×Q Cut buffer 5ul，

ddH2O 41.5ul

37℃，3h，电泳回收后浓度50ng/ul

②infusion（20ul体系）

摩尔比👉载体:片段=1:2（0.03pmol：0.06pmol）

最适载体量：0.03×4324bp×0.65=84ng

最适片段量：0.06×3513bp×0.65=137ng

载体 1.8ul

片段 0.6ul

5×CE II buffer 4ul

Exnase II 2ul

dd H2O 11.6ul

37℃，30min

③转化

infusion产物+50ul感受态，冰浴静置30 min；42℃热激45s，加800ul LB，200rpm，37℃，摇床1h（也试过1h30min）

涂板，37℃培养12-16h，不长菌落

尝试师姐做成功的片段，自己做一遍还是不长菌，按理是自己操作有问题，可是师姐看着我操作的，我到底有什么步骤遗漏了，求各位老师指教！！！