4kb载体与3kb片段连接一直不长菌落
alaalaya
各位老师好，最近做无缝克隆一直不成功，具体过程如下，求指教。
载体4234bp；目的片段3513bp
①载体线性化（50ul体系）
载体（600ng/ul）2ul，
EcoR I 0.75ul，Xho I 0.75ul，
10×Q Cut buffer 5ul，
ddH2O 41.5ul
37℃，3h，电泳回收后浓度50ng/ul
②infusion（20ul体系）
摩尔比👉载体:片段=1:2（0.03pmol：0.06pmol）
最适载体量：0.03×4324bp×0.65=84ng
最适片段量：0.06×3513bp×0.65=137ng
载体 1.8ul
片段 0.6ul
5×CE II buffer 4ul
Exnase II 2ul
dd H2O 11.6ul
37℃，30min
③转化
infusion产物+50ul感受态，冰浴静置30 min；42℃热激45s，加800ul LB，200rpm，37℃，摇床1h（也试过1h30min）
涂板，37℃培养12-16h，不长菌落
尝试师姐做成功的片段，自己做一遍还是不长菌，按理是自己操作有问题，可是师姐看着我操作的，我到底有什么步骤遗漏了，求各位老师指教！！！
3 个回答
bamboopiggy
你热激后加的是空白的lb吗？不是带抗性的吧？如果你师姐能做成来，至少证明片段什么的没问题，那就考虑是什么液体加错了。
天一湖医者
可能有几个导致不长菌的原因：
1.感受态细胞是否失活：可以在下次实验时加入阳性对照组，向同批感受态细胞中转入阳性质粒以确认其活性；
2.抗性药物是否错误：重新确认一下重组质粒的抗性，以免用错抗性药物进行菌落筛选，导致不长菌；
3.载体是否正常工作：可以向载体中连入其它已成功连接过的短片段，转化感受态后观察其菌落生长情况，以确定载体是否正常工作。
dxy_g9y5gije
说实话，看操作确实没有问题
不长菌落我觉得可以考虑一下细节上有没有问题
第一，所用的试剂是否完好
第二，能否确保连接成功
第三，培养基抗性是否正确
第四，所用设备是否满足实验条件
