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【资源】蛋白纯化经验指南()

蛋白纯化经验指南()摘自中国色谱网1) 白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请我现在手头有个融合蛋白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用蛋问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有50~60%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,我用0.5%CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的 ...

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蛋白质含量测定法 哪个学校的讲义?

实验一 蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比 ...

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SPR(表面等离子体共振)技术

生物传感器是利用附着在传感器界面上的待测生物分子与环境化学物质,或特定分子间专一性的交互作用后产生 感应信号,作为生物分子间交互作用(biomolecular interaction analysis,BIA)的检测装置。随着微机电及光电技术迅速发展,整合了光机电并应用于生物传感器上,已经开发出不同的研究领域,如:共轭焦镭射扫描荧光显微术 (confocal laser scanning fluorescence microscopy,C ...

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【专题讨论】itraq实验数据常用的数据分析

给大家分享一下做了两次itraq实验和分析后的一些经验,有什么说的不对的,请各路大神指教蛋白质组学中itraq数据一般来说做如下分析的比较多1.差异蛋白筛选 2.层次聚类分析 3.差异蛋白GO分类 4.差异蛋白pathway分析 5.差异蛋白互作网络构建我也只能简单介绍一下这些数据分析1.差异蛋白筛选,一般用到的两个值是foldchange值和p值,其中前者是表达量的倍数值,后者是学氏-T检验值,一般都是运用这个两个值来筛选的 ...

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【原创】非变性凝胶电泳的方法和应用实例

现在大家都是做SDS-PAGE或者双向电泳比较多,而做非变性电泳的似乎少一些。而我本人接触非变形电泳较多,一直认为它还是很有特点的,能够有很多独特应用之处的,所以在此结合我本人经历向大家介绍一下非变性电泳。非变性电泳,蛋白质在电泳过程中是处于非变性的,电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷和分子量,非变性电泳在完成电泳后,可以进行蛋白质活性测定(如果是酶的话,可以进行酶活检测)或者检测同功酶,或含亚基的完整蛋白的分 ...

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【原创】taq酶表达的一些个人经验

最近做了taq酶的表达和纯化,将优化的实验流程和一点心得贴上来,希望对大家有帮助,更希望得到批评和指正TaqDNA聚合酶表达载体的构建与提取纯化1 .背景重组TaqDNA聚合酶基因及表达载体插入重组Taq DNA聚合酶基因的pET-28a表达质粒,该质粒是由美国Novagen公司推出的能在大肠杆菌中高效表达的一种质粒载体。该质粒在克隆位点前有1个T7启动子,在T7启动子前有1个6×His-Tag coding序列,是T ...

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【活动】《有奖抓图》蛋白质技术讨论版第90000帖 !

迎来金秋十月,蛋白版作为实验技术讨论区一个重要的板块,长久以来得到众多热心的战友厚爱和支持。为了答谢战友们的关心和维护,现举办九万帖有奖抓图活动,希望广大战友在这个充满激情的十月变得更加富有活力。在这里感谢大家长久以来的热心和关爱,你们才是蛋白版的支柱和主人加分办法:奖励第90000帖发帖战友和首先抓图并贴图者(以贴图时间最先者为准):1 、抓到第90000贴抓图的可加分,时间以发贴时间/修改时间为判断标准。发贴时 ...

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【原创】western荧光淬灭的解决办法

不记得是07还是08年我发过一个帖子,询问western淬灭的解决办法,至今,仍有站有私信我关于这个问题的解决办法。与其一个一个的回复,还是发个帖子,特别说明,帮助更多的朋友走出这个困扰。从私信我的站友的数量上看,western淬灭的现象还是挺普遍的。解决的办法其实非常简单,也常常有人提及,只是我们对这个改进有时不敢相信,或者没有做到相应的程度。呵呵,不卖关子了,下面就对荧光淬灭的现象形成和解决办法做一个详细的解 ...

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新蛋白发现和预测

针对核酸序列的新蛋白预测就是在核酸序列中寻找基因,找出基因的位置和功能位点的位置,以及标记已知的序列模式等过程。在此过程中,确认一段DNA序列是一个基因需要有多个证据的支持。一般而言,在重复片段频繁出现的区域里,基因编码区和调控区不太可能出现;如果某段DNA片段的假想产物与某个已知的蛋白质或其它基因的产物具有较高序列相似性的话,那么这个DNA片段就非常可能属于外显子片段;在一段DNA序列上出现统计上的规律性 ...

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蛋白质技术资源ftp共享须知

为了响应ftp资源讨论版不再处理站友的上传申请而由各专业讨论版的版主负责的举措,现做出以下说明:1.有关蛋白质技术的资源希望通过ftp共享,请在本版 http://www.dxy.cn/bbs/post/page?bid=65&sty=1&age=0&s=493 发新帖申请,一般有五人以上需要后即发给上传密码。是否加分鼓励,由本版的版主根据情况决定。对于不易界定专业的资源,以及部分比较难得的精品,仍然在ftp资源讨论版发帖申请。2. ...

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【转帖】蛋白质的自述,有趣

蛋白质的自述 我姓蛋,名白质。出生在核仁医院里,从小我就没有见过我的父母,据护士姐姐告诉我,我是由mRNA大叔和tRNA阿姨把我送进医院的,而我的父母DNA早在我还没有出生的时候就过世了,这在常理来说有点奇怪,可我们蛋氏家族向来如此。我的父母在死前留下了一串密码,用了家族的语言—核苷酸语,只有我们家族的人才能看懂,交给了mRNA叔叔:3个核苷酸编码就是一种氨基酸,tRNA阿姨就帮我找来了氨基酸,才让我得以诞生。我非常 ...

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【资源】蛋白质组学研究资源--不看还是做蛋白的吗?

一、蛋白质数据库1.UniProt (The Universal Protein Resource)网址:http://www.uniprot.org/http://www.ebi.ac.uk/uniprot/简介:由EBI(欧洲生物信息研究所)、PIR(蛋白信息资源)和SIB(瑞士生物信息研究所)合作建立而成,提供详细的蛋白质序列、功能信息,如蛋白质功能描述、结构域结构、转录后修饰、修饰位点、变异度、二级结构、三级结构等,同时提供其他数据库,包括 ...

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【专题讨论】dominant negative及在蛋白质功能研究中的应用

想和大家讨论一下关于dominant negative的问题。首先,什么是dominant negative?在网上查到的解释多为:显性抑制---虽然多数的突变都隐性的,可是在遗传学的实验上,也曾观察到显性的突变,如果这突变会抑制或破坏某一正常的功能,就称之为“显性抑制”。在实验中给野生型表达或转入无功能的基因或目的蛋白无功能类似物,观察是否会影响原来也具有正常功能的基因或蛋白的作用。一般用于验证实验的准确性。就我的理解, ...

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【原创】原核表达的心得

最近2个月都在做原核表达,刚开始什么都不会,连SDS-PAGE都跑成模糊的一片,其中的辛酸只有自己知道,现在实验慢慢上正轨了,自己也积累了一些经验。很怀恋之前探索的那段时光,现在把我做蛋白表达的过程和一些问题写出来,希望能够帮助开始做蛋白表达的人少走一些弯路。1、表达载体的构建构建表达载体是比较简单的,不过也是需要对你的蛋白还有所用的载体有一个详细的认识,对于比较大的蛋白最好选用能够助溶的标签,但是也不是固定的 ...

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【原创/分享】GS115毕赤酵母表达外源蛋白较详细步骤!!!(从验证到阳性克隆的筛选)

小弟把最近一个多月来所做的工作,做了个总结,供大家一起分享,希望版主能加分,现在我还是0分,很多帖子不能阅览,希望版主加分,今后我实验有了新的进展,我会把总结发上来,和大家一起分享。我做的是GS115表达VEGF,目前已经做到阳性克隆的筛选这一步。待以后再次做了总结,再与大家分享。希望大家支持,绝对原创!!!一.实验材料1.菌珠E.coli DH5αGS115酵母菌2.质粒PIC9K/VEGF165重组质粒3.试剂NB酵母氮 ...

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【资源】把您的实验好习惯说出来!

把您的实验好习惯说出来! 作者:judge0zz8 文章来源:科学网论坛 实验中的每个环节都很重要,忽略任何一个都可能导致实验的失败。良好的习惯可以提高工作效率、降低实验成本、实验中出现0失误!每个人在实验中都有自己的一些好的习惯,把您的好习惯说出来吧!让大家相互学习,让大家一起把实验做好! 下面整合了其他论坛里的一些心血,抛砖引玉,希望大家都把自己的优点说出来: tip头吸完后马上从移液器上取下来,以免忙乱的时候又以同一tip汲取 ...

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【原创】western使用试剂汇总----实际操作版

western使用试剂汇总个人做western已快半年,下面把个人用过的试剂总结一下,可能每个人做的蛋白不一样会有少许出入。但以下试剂应该是必备!希望对各位新做western的朋友有个帮助。主要产品可在公司订购。建议刚开始做先不要买小公司产品,尽量用大公司成套产品做稳定了,再想着从小公司买便宜试剂或粉剂自己配制,以节约费用。其实国内许多公司的成套试剂,质量还不错,比自己配要方便,节约时间。一般产品公司的网站都有 ...

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【转帖】毕赤酵母表达从入门到精通

毕赤酵母表达从入门到提高本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍,此外,一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结,仅供大家参考,同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等;如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。若本文侵犯了您的版权或有任何不妥,请Email:kaosy@163.com告知。此外,由于学识、经验有限,本文难免会存在一些错误或缺陷,敬请不吝赐教,联系方式:kaosy@163 ...

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蛋白质预测的一些资料

前两天在网上提问,有不少朋友回答,万分感谢,后来我的一位同学给我寄来了科学出版社的一本蛋白质预测的书的WORD版,放在这儿给需要的人看看。 涉及到的因特网资源物理性质预测: Compute PI/MW http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/pi-tool.html Peptidemass http://expaxy.hcuge.ch/sprot/peptide-mass.html TGREASE ftp://ftp.virginia.edu ...

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关于论坛中所有Native PAGE/非变性电泳及蛋白回收的经典总结

SDS-PAGE从胶中纯化蛋白质浸提液母液:0.5 mol/L Tris-CI pH 7.91.0 mmol/L EDTA1.5 mol/L NaCL1.0 % SDS上述各取1ml 混匀,加入6 ml 水,混匀,即为10ml 浸提液。回收蛋白方法:1. 使用厚胶,设两个样品孔,一个为蛋白marker,另一为样品。2. 电泳结束后,将Marker和少许样品带切下,进行染色和脱色。剩余样品胶置于4 ℃。3. 根据Marker和被染色的样品带,切下未被染色的胶中蛋白带。4. 称重,研碎,加入3~5倍体积的浸 ...

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