蛋白质磷酸化的检测方法 欢迎大家授业解惑

我总结了一下：
具体有几类，但有些问题想请教大家。
1，  由于很多蛋白有各自的特性，我们遇到需要检测磷酸化的时候，可以检索文献资料，看看是否有可靠的方法可选择。
2，  一些蛋白磷酸化后其生物学功能会发生改变，可以通过检测生物学功能的变化来间接检测其磷酸化是否发生。
但是这个办法操作性很差，因为需要提取蛋白并且需要保证其活性，同时也需要一定量才可以达到可以检测到活性变化的水平。
3，  此外有非特异性的丝，酪氨酸磷酸化抗体，具体情形我不清楚，希望用的的兄弟仔细说说。不过我估计应该是单抗特异性检测某个氨基酸的磷酸化。所以只要有磷酸化就可以发生免疫反应。搜索论坛发现一个同志已经做了一定阐述，希望可以获得进一步解答。
“如果没有针对该蛋白的酪氨酸磷酸化抗体,那需要先用该蛋白的抗体进行共沉淀，然后用非特异性的酪氨酸磷酸化抗体进行WB的检测；另外也有将纯化细胞内磷酸化蛋白柱子，可以先将细胞内的磷酸化蛋白纯化下来，然后用该蛋白的抗体进行WB的检测；”

先将蛋白共沉淀是不是为了分离这个蛋白，因为其他蛋白抽提方法都是分离总的蛋白，而非特异性的丝，酪氨酸磷酸化抗体只是识别单氨基酸是否磷酸化，而总蛋白中其他所有的丝，酪氨酸磷酸化蛋白都会被探测到的缘故。
先用柱子纯化磷酸化总蛋白，再用特殊抗体检测实际上是分离先后顺序不同而已。

4，  如果有可以特异识别目的蛋白的磷酸化的抗体，那么直接western blot 就可以检测了。
5，  还有蛋白质磷酸化后电泳速率改变，磷酸化后减慢。这也是可以分辨磷酸化状态的，此时只需要一个特异性抗体就行了是不是？？？ 但是我看大家的意思这个抗体还必须是第4段我提到的那个特殊抗体。 但是既然电泳速度改变，我认为一般的抗体也行啊。第4段那个方法事实上应该western blot只有一条带才对。因为一种磷酸化方式对应一条带，一个特殊抗体。
我看一个论文，他western blot用的什么抗体没有说明，就说某个蛋白的多抗。然后结果有未磷酸化，p1类型磷酸化，p2类型磷酸化，p3类型磷酸化四个带，我估计利用电泳速率变化来分辨应该是一种普通的抗体就行，这个抗体不需要分辨是否磷酸化。磷酸化与否是通过电泳速率快慢完成的。
但是蛋白磷酸化是否一定速率变化的可以分辨是问题一，是否一定变慢没有特殊是问题二，我估计这个方法不是每个蛋白都适合，估计应用时需要文献的支持，人家可以做咱也可以，否则就可能要摸索了。
6，  其他还有检测底物的转肽来间接反映蛋白的酪氨酸磷酸化状态的，具体情况具体分析 ，这个我没有看懂，不知道是不是就是我说得第二点。

中华劳动卫生职业病杂志 2002年 12月 20卷 6期
附件如下，就是检测磷酸化的。 维普的浏览器打开