【专题讨论】蛋白质定点突变——PCR方法的应用
丁香园论坛
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后基因组时代，蛋白质研究又掀起新一轮的高潮，掌握基础的蛋白质技术，是蛋白质研究这个行当中所有人都应该做的。蛋白质技术包括太多，我在这里只想与战友们一起讨论关于蛋白质定点突变的技术。结合自己的实验研究，我翻译了一些手头的资料，拿到这里跟大家讨论，园子里高人甚多，希望我这块砖能引出更多的玉来。
参考文献：PCR Approaches to DNA Mutagenesis and Recombination
---An Overview
Binzhang Shen
Methods in molecular biology, vol 192， 167-174
简介：
PCR 技术的进步已经让我们可以有目的地对基因进行突变与重组。这在后基因组时代，意义非常重大，这是一种强大的工具来研究功能基因组学，基因表达，蛋白质结构功能关系，蛋白质相互作用，蛋白质工程，以及体外酶的进化。
要想完整彻底地探讨PCR 在突变与重组DNA中的应用，那是 mission impossible 。
对PCR体系的成分进行周密的加工处理，就可以得到核苷酸变化，缺失，插入等等突变结果。突变的策略之一是建立在所谓mispriming的基础上的，因为PCR反应时，可以容忍一定程度的引物与模板的错配，预想的突变可以事先设计在引物之上。
另一种策略是PCR介导的体外重组，是通过形成异源双链核酸分子（heteroduplex）来达到目的。主要有两种方法。一，通过形成重叠引物区“缝合”形成异源双链核酸分子。二，异源双链核酸分子可以在每个PCR后自动生成并延长。
具体采用什么策略和方法，要依试验者的目的，模板种类（线性，环状），和效率来定。有时候，需要进行一些小的修正，有时候 需要把不同的方法结合起来使用。
突变引物：
大多数的PCR反应需要的是引物与模板之间的完美配对，但事实上，突变引物或者称之为错配引物在一定条件下也能进行PCR 反应，虽然效率不是很高，这些条件包括：
无完美配对存在
使用低退火温度
错配核苷酸位于引物的5 端，或者位于较长引物的中间区域
一个突变引物在设计上可以包括核苷酸变换，小片段的缺失与插入。因为引物在PCR后出现在产物中，突变也就同样如此了。一般讲来，突变引物用于扩增出突变基因，或者使PCR产物易于克隆。
突变的位点：
比如在附图中的，突变方法之Fig. 1.1，这种方法称为简单PCR (SPCR)。突变PCR后，突变位点只能位于产物的末端。
为了克服突变位点只能位于产物的末端这个缺点， Ho 等人设计了 Overlap Extension PCR (OEPCR) ，Fig. 1.2 ，使用了两个重叠引物，和两个外侧引物。先进行两个独立的 PCR ，产物拿来退火和延伸，产物可用两个外侧引物PCR扩增。重叠引物的设计是OEPCR的关键。OEPCR 的缺点是效率偏低，究其原因在于重叠区域比较短而造成。
长引物PCR (Megaprimer PCR，MPCR)（Fig. 1.3） 后来被发展应用，弥补了 OEPCR效率偏低的缺陷。首先利用简单PCR制造出含突变位点的长引物，纯化以后以引物（长引物的名称由此而来）的身份参与第二轮PCR 。与 OEPCR相比，MPCR的优点还有，设计使用的引物较少，引物模板之间的同源互补性高。
为了突破简单PCR（SPCR）的限制，人们使用了环状模板，首先把待突变的DNA分子装入载体，用以对尾对尾引物扩增（inverted PCR, IPCR, Fig 1.4），产物转化入宿主细胞环化，扩增。这样的方法也能把突变位点引入基因的任何位子。
参考文献：PCR Approaches to DNA Mutagenesis and Recombination
---An Overview
Binzhang Shen
Methods in molecular biology, vol 192， 167-174
简介：
PCR 技术的进步已经让我们可以有目的地对基因进行突变与重组。这在后基因组时代，意义非常重大，这是一种强大的工具来研究功能基因组学，基因表达，蛋白质结构功能关系，蛋白质相互作用，蛋白质工程，以及体外酶的进化。
要想完整彻底地探讨PCR 在突变与重组DNA中的应用，那是 mission impossible 。
对PCR体系的成分进行周密的加工处理，就可以得到核苷酸变化，缺失，插入等等突变结果。突变的策略之一是建立在所谓mispriming的基础上的，因为PCR反应时，可以容忍一定程度的引物与模板的错配，预想的突变可以事先设计在引物之上。
另一种策略是PCR介导的体外重组，是通过形成异源双链核酸分子（heteroduplex）来达到目的。主要有两种方法。一，通过形成重叠引物区“缝合”形成异源双链核酸分子。二，异源双链核酸分子可以在每个PCR后自动生成并延长。
具体采用什么策略和方法，要依试验者的目的，模板种类（线性，环状），和效率来定。有时候，需要进行一些小的修正，有时候 需要把不同的方法结合起来使用。
突变引物：
大多数的PCR反应需要的是引物与模板之间的完美配对，但事实上，突变引物或者称之为错配引物在一定条件下也能进行PCR 反应，虽然效率不是很高，这些条件包括：
无完美配对存在
使用低退火温度
错配核苷酸位于引物的5 端，或者位于较长引物的中间区域
一个突变引物在设计上可以包括核苷酸变换，小片段的缺失与插入。因为引物在PCR后出现在产物中，突变也就同样如此了。一般讲来，突变引物用于扩增出突变基因，或者使PCR产物易于克隆。
突变的位点：
比如在附图中的，突变方法之Fig. 1.1，这种方法称为简单PCR (SPCR)。突变PCR后，突变位点只能位于产物的末端。
为了克服突变位点只能位于产物的末端这个缺点， Ho 等人设计了 Overlap Extension PCR (OEPCR) ，Fig. 1.2 ，使用了两个重叠引物，和两个外侧引物。先进行两个独立的 PCR ，产物拿来退火和延伸，产物可用两个外侧引物PCR扩增。重叠引物的设计是OEPCR的关键。OEPCR 的缺点是效率偏低，究其原因在于重叠区域比较短而造成。
长引物PCR (Megaprimer PCR，MPCR)（Fig. 1.3） 后来被发展应用，弥补了 OEPCR效率偏低的缺陷。首先利用简单PCR制造出含突变位点的长引物，纯化以后以引物（长引物的名称由此而来）的身份参与第二轮PCR 。与 OEPCR相比，MPCR的优点还有，设计使用的引物较少，引物模板之间的同源互补性高。
为了突破简单PCR（SPCR）的限制，人们使用了环状模板，首先把待突变的DNA分子装入载体，用以对尾对尾引物扩增（inverted PCR, IPCR, Fig 1.4），产物转化入宿主细胞环化，扩增。这样的方法也能把突变位点引入基因的任何位子。
