请问蛋白质组学研究中的蛋白质定量方法有哪些?各自的应用范围和优缺点是什么?

紫外分光光度法、 凯氏定氨法、双缩脉法Folin-酚试剂法(Lowry法)、BCA法、胶体金法。考马斯亮蓝染色法、银染法、 荧光法

主要有以下几种方法:

1. Label-free

Label-free，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定蛋白肽段在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。

2. iTRAQ

同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ) 技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

3. SILAC

SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture, SILAC)，其实验流程是在细胞培养基中加入轻、中或重型稳定同位素标记的必需氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，通过细胞的正常代谢，使新合成的蛋白带上稳定同位素标签。等量混合各类型蛋白质，酶解后进行质谱分析。通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而进行蛋白鉴定。

4. MRM

MRM是一种基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式，属于目标蛋白质组。关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导，从而去除其他子离子的干扰，只对选定的特异离子进行质谱信号的采集。

5. SWATH

SWATH是一项全新的质谱采集模式技术，是 MS/MSALL技术的一种扩展。与传统的shot-gun技术相比，SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂，从而获得完整的肽段信息，是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。

①Bradford 法。其原理为，蛋白质与染料考马斯亮蓝 G-250 结合，使得染料最大吸收峰从 465nm 变为 595nm，在一定的线性范围内，反应液 595nm 处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定 595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。能耐受较高的还原剂，例如DTT可达5mM,但是不能耐受去垢剂如SDS要低于0.1%，去垢剂会严重影响定量结果。

②BCA 法。其原理为，在碱性环境下，蛋白与Cu2+络合并将Cu2+ 还原成Cu1+（biuret reaction）。 BCA与Cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在 562nM 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。能耐受较高的去垢剂，比如SDS能达到4%，但是不能耐受还原剂，DTT必须在0.2mM以下。

因此如何选择定量方法主要依据蛋白溶液成分，通过稀释样本等方式使溶液成分都在定量方法的耐受范围内

一：化学标记法 — iTRAQ定量蛋白质组学实验方法技术优势：（1）灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白。（2）分离能力强,分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。（3） 高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析。（4）结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠。（5）自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。技术应用1. 蛋白鉴定和定量；

2. 差异蛋白的筛选和鉴定。

二：双向电泳法技术优势：1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料；2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。

三：双向荧光差异凝胶电泳（DIGE）法技术优势：（1）高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量；（2）与常规银染相比灵敏度更高；（3）检测动态范围更大；（4）定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差；（5）统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。

① 根据物理性质：紫外分光光度法

② 根据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法。

③ 根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。

④ 根据其他性质：荧光法