材料与仪器
Folin-Ciocalteu 试剂 硫酸铜试剂 碱性铜试剂
步骤
碱性铜还原分析法 (Lowry 法）（Lowryetal.，1951) 和其他能够增强检测性能的方法都是基于一个包括两个步骤的过程。首先，双缩脲反应涉及蛋白质在碱性溶液环境中将铜还原（由Cu2+到 Cu+); 随后是反应增强的阶段,Folin-Ciocalteu 试剂 (憐钼酸盐和憐钨酸盐)(PeterSon,1979) 被还原后产生一种在 750nm 处有最大吸光度的蓝色物质。这种检测方法因蛋白质序列的不同而有所变化，因为颜色的产生不仅取决于还原的铜-酰胺类复合物，而且还与酪氨酸、色氨酸有关，在较小的程度上还与胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸残基等有关 (Peterson,1977;Wuetal.，1978)。
Lowry 法已经被改良以减少其对干扰物的敏感性、增加动态范围、缩短检测时间以及产生稳定的颜色生成物 (Peterson,1979)。有许多商业来源的改良 Lowry 法 (Roche、Pierce、Bio-Rad 和 Sigma)，但不同的制剂可能不会得到相同的结果数据，即便是使用相同的标准品、稀释缓冲液或存在相同的干扰物质。
1.向 1 mL 含量为 5~100pg/mL 的一系列蛋白质标准品及该浓度范围内的待测样品中分别加入 ImL 碱性铜试剂，混匀, 室温放置 10 min。
2.加人 0~5 mL Folin-Ciocalteu 试剂混合物，祸旋使之充分混匀，孵育 30 min。
3.孵育完成后再次涡旋混匀，检测 750mn 处的吸光度。
吸光度的读取范围可以从 650~750nm, 这取决于可用的合适的滤光器 (酶标仪），或者，如果信号太强，不会对检测性能产生显著的影响。Lowry 法不是端点检测（endp0intassay)，所以样品检测应该交错进行以获得更精确的测量值。
4.在有限的标准品浓度范围内观察到的反应将是线性的。可用多项式、指数和对数模型拟合数据以扩大反应曲线的动态范围。
上述的 Lowry 法可适应于微孔板，以减少所加人反应物的体积，产生的动态为 50~500 ug/mL。由于灵敏度、线性及方法学上的进步，Lowry 法已基本被 BCA 法所取代。
Lowry 法对许多干扰性化合物敏感 (表 8.1)，对于这些物质可能不会产生线性反应 (因而导致要推断复杂的干扰数据）。去污剂、脂类、钾离子和磷酸钠的存在会导致沉淀产生。
Lowry 法已经被改良以减少其对干扰物的敏感性、增加动态范围、缩短检测时间以及产生稳定的颜色生成物 (Peterson,1979)。有许多商业来源的改良 Lowry 法 (Roche、Pierce、Bio-Rad 和 Sigma)，但不同的制剂可能不会得到相同的结果数据，即便是使用相同的标准品、稀释缓冲液或存在相同的干扰物质。
1.向 1 mL 含量为 5~100pg/mL 的一系列蛋白质标准品及该浓度范围内的待测样品中分别加入 ImL 碱性铜试剂，混匀, 室温放置 10 min。
2.加人 0~5 mL Folin-Ciocalteu 试剂混合物，祸旋使之充分混匀，孵育 30 min。
3.孵育完成后再次涡旋混匀，检测 750mn 处的吸光度。
吸光度的读取范围可以从 650~750nm, 这取决于可用的合适的滤光器 (酶标仪），或者，如果信号太强，不会对检测性能产生显著的影响。Lowry 法不是端点检测（endp0intassay)，所以样品检测应该交错进行以获得更精确的测量值。
4.在有限的标准品浓度范围内观察到的反应将是线性的。可用多项式、指数和对数模型拟合数据以扩大反应曲线的动态范围。
上述的 Lowry 法可适应于微孔板，以减少所加人反应物的体积，产生的动态为 50~500 ug/mL。由于灵敏度、线性及方法学上的进步，Lowry 法已基本被 BCA 法所取代。
Lowry 法对许多干扰性化合物敏感 (表 8.1)，对于这些物质可能不会产生线性反应 (因而导致要推断复杂的干扰数据）。去污剂、脂类、钾离子和磷酸钠的存在会导致沉淀产生。
来源：丁香实验
