外源基因在宿主细胞中的高效表达(愚见)
丁香园论坛
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外源基因在宿主细胞中的高效表达
1．有效的转录起始与基因的高效表达
有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键性步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要的限速步骤。因此，选择强的可调控的启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起的细胞死亡等问题。对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如lac,trp,λPr,tac,phoA等，和组成型启动子，如T7噬菌体启动子。而对于真核细胞的表达载体而言，启动子和增强子作为两个重要的转录控制序列，是外源基因在真核细胞中高效表达所必需的。
2．mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达
转录开始后，mRNA 开始进行有效延伸，终止以及稳定的积累，在这个过程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的mRNA分子提前终止。衰减子位点具有简单终止子的特性，在原核细胞中其处于生物合成的操纵子的启动子和第一个结构基因之间。由于衰减子序列是负调节元件，为保证mRNA转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。为了防止mRNA在转录过程中的非特性终止，抗终止序列元件可加入到表达载体上。正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性。对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和poly A加入位点，使外源基因高效表达的重要因素。当将转录终止信号置于两个转录单位之间，防止转录从前一个转录单位扩展到后面一个转录单位。Poly A加入的信号序列AAUAA对于mRNA 3’端的正确加工和poly A的加入至关重要，有实验指出，AAUAA位点的缺失，使基因的表达减少10倍。
3．有效的翻译起始与基因的高效表达
在原核细胞中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合部位(SD)、起始密码子与SD的距离和核苷酸组成、mRNA的二级结构以及其上游5‘非翻译区序列和蛋白质编码区的5‘端序列等。
作为翻译起始，可达到最大效率的一般原则是：
1） AUG(ATG)是最首选的起始密码子。GUG,UUG, AUU和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。
2) SD序列中至少含有AGGAGG序列中的四个碱基。
3) SD与起始密码之间的距离以9±3为适宜
4) 如果在起始密码子AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高
5) 在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件易被核糖体识别和结合
6) 通过突变mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列，去减少、去除某些stem-loop结构可以提高翻译的起始效率。
对于真核细胞而言，一个共有的序列CCA(G)CCATGG是必需的；此外，在起始密码的上游区如果存在另外一个起始密码，而特别是这个起始密码又不被其后的一个符合读框的终止密码所隔离，那么上游起始密码会损害翻译的起始。
4．遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达
在翻译过程中，翻译的速度不是恒速的，而是一个不连续的过程，其主要原因是由于核糖体对遗传密码具有选择性，高表达的基因经常使用所谓的偏倚性密码。尤其是对于基因编码序列的5‘端，使用偏倚密码更能提高表达效率。大肠杆菌及其所有的生物的mRNA 中都含主密码子（偏倚密码）和罕用密码子，关联tRNA 的水平是与相应的密码子的使用频率成正比的。如果外源基因mRNA 中的密码子的分布情况或外源蛋白中所含有的氨基酸组成的分布情况同在大肠杆菌中正常情况一致，那么大肠杆菌细胞能够使相适应的tRNA 氨酰化，保持翻译正常进行和减少错误事件。如果从克隆来的基因含有罕用密码子或其氨基酸组成的分布不正常的偏离典型大肠杆菌的氨基酸分布组成，那么外源基因在表达过程中，由于没有足够的与之相适应的tRNA ，其蛋白质合成的质和量都受到影响。
5．mRNA 的二级结构与基因的高效表达
无论真核还是原核基因的表达，翻译的起始常被mRNA 不适当的二级结构所影响。转录及翻译起始区的二级结构，对转录和翻译有决定性的影响。我们知道，翻译起始的速率决定于翻译起始符合物能否有效的形成，而这种复合物的有效形成，在一定程度上取决于翻译起始区的二级结构。若其二级结构比较松散，无明显的茎环结构，这样有利于复合物的形成，从而使得翻译起始得以有效进行。
6．mRNA序列上终止密码的选择
在大肠杆菌中合成完了的多肽链的释放由两个释放因子所调控，RF1识别UAA和UAG，而RF2识别UAA和UGA。而在真核细胞中也有两个释放因子eRF。三个终止密码在他们翻译终止效率上是不同的，其中UAA在基因高水平表达中终止效率最好。特别是在原核细胞中，由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因合成中，一般采用UAA作为终止码。在实际的操作中，为了保证翻译的有效终止，采用串联的终止密码，而不是一个终止密码。近来的研究也表明，终止密码是四个核苷酸组成的顺式序列，而不是由三个核苷酸组成的序列，如对大肠杆菌常用UAAU作为有效终止密码。
7．外源蛋白的稳定性与基因的高效表达
外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶所降解，这是基因高效表达的一个重要参数。如何避免外源蛋白被选择性的降解，可采用以下几种方式：
1）通过组建融合基因的方法，产生融合蛋白。融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解。这种通过融合蛋白表达外源基因，特别是为相对分子质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适。
2）产生可分泌的蛋白，如外源基因表达产物可以分泌到大肠杆菌的周质或者直接分泌到培养基中。
3）外源蛋白可以在宿主细胞中以包含体的形式表达，这种不溶的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，以便于纯化。
4）选择合适的受体表达系统，如选择蛋白水解酶基因缺陷型菌株，然而这种蛋白酶基因缺陷型细胞，往往生长不正常，且不稳定。应该指出，受体细胞的选择是保证外源基因有效表达的最重要的因素之一。
1．有效的转录起始与基因的高效表达
有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键性步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要的限速步骤。因此，选择强的可调控的启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起的细胞死亡等问题。对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如lac,trp,λPr,tac,phoA等，和组成型启动子，如T7噬菌体启动子。而对于真核细胞的表达载体而言，启动子和增强子作为两个重要的转录控制序列，是外源基因在真核细胞中高效表达所必需的。
2．mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达
转录开始后，mRNA 开始进行有效延伸，终止以及稳定的积累，在这个过程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的mRNA分子提前终止。衰减子位点具有简单终止子的特性，在原核细胞中其处于生物合成的操纵子的启动子和第一个结构基因之间。由于衰减子序列是负调节元件，为保证mRNA转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。为了防止mRNA在转录过程中的非特性终止，抗终止序列元件可加入到表达载体上。正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性。对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和poly A加入位点，使外源基因高效表达的重要因素。当将转录终止信号置于两个转录单位之间，防止转录从前一个转录单位扩展到后面一个转录单位。Poly A加入的信号序列AAUAA对于mRNA 3’端的正确加工和poly A的加入至关重要，有实验指出，AAUAA位点的缺失，使基因的表达减少10倍。
3．有效的翻译起始与基因的高效表达
在原核细胞中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合部位(SD)、起始密码子与SD的距离和核苷酸组成、mRNA的二级结构以及其上游5‘非翻译区序列和蛋白质编码区的5‘端序列等。
作为翻译起始，可达到最大效率的一般原则是：
1） AUG(ATG)是最首选的起始密码子。GUG,UUG, AUU和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。
2) SD序列中至少含有AGGAGG序列中的四个碱基。
3) SD与起始密码之间的距离以9±3为适宜
4) 如果在起始密码子AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高
5) 在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件易被核糖体识别和结合
6) 通过突变mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列，去减少、去除某些stem-loop结构可以提高翻译的起始效率。
对于真核细胞而言，一个共有的序列CCA(G)CCATGG是必需的；此外，在起始密码的上游区如果存在另外一个起始密码，而特别是这个起始密码又不被其后的一个符合读框的终止密码所隔离，那么上游起始密码会损害翻译的起始。
4．遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达
在翻译过程中，翻译的速度不是恒速的，而是一个不连续的过程，其主要原因是由于核糖体对遗传密码具有选择性，高表达的基因经常使用所谓的偏倚性密码。尤其是对于基因编码序列的5‘端，使用偏倚密码更能提高表达效率。大肠杆菌及其所有的生物的mRNA 中都含主密码子（偏倚密码）和罕用密码子，关联tRNA 的水平是与相应的密码子的使用频率成正比的。如果外源基因mRNA 中的密码子的分布情况或外源蛋白中所含有的氨基酸组成的分布情况同在大肠杆菌中正常情况一致，那么大肠杆菌细胞能够使相适应的tRNA 氨酰化，保持翻译正常进行和减少错误事件。如果从克隆来的基因含有罕用密码子或其氨基酸组成的分布不正常的偏离典型大肠杆菌的氨基酸分布组成，那么外源基因在表达过程中，由于没有足够的与之相适应的tRNA ，其蛋白质合成的质和量都受到影响。
5．mRNA 的二级结构与基因的高效表达
无论真核还是原核基因的表达，翻译的起始常被mRNA 不适当的二级结构所影响。转录及翻译起始区的二级结构，对转录和翻译有决定性的影响。我们知道，翻译起始的速率决定于翻译起始符合物能否有效的形成，而这种复合物的有效形成，在一定程度上取决于翻译起始区的二级结构。若其二级结构比较松散，无明显的茎环结构，这样有利于复合物的形成，从而使得翻译起始得以有效进行。
6．mRNA序列上终止密码的选择
在大肠杆菌中合成完了的多肽链的释放由两个释放因子所调控，RF1识别UAA和UAG，而RF2识别UAA和UGA。而在真核细胞中也有两个释放因子eRF。三个终止密码在他们翻译终止效率上是不同的，其中UAA在基因高水平表达中终止效率最好。特别是在原核细胞中，由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因合成中，一般采用UAA作为终止码。在实际的操作中，为了保证翻译的有效终止，采用串联的终止密码，而不是一个终止密码。近来的研究也表明，终止密码是四个核苷酸组成的顺式序列，而不是由三个核苷酸组成的序列，如对大肠杆菌常用UAAU作为有效终止密码。
7．外源蛋白的稳定性与基因的高效表达
外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶所降解，这是基因高效表达的一个重要参数。如何避免外源蛋白被选择性的降解，可采用以下几种方式：
1）通过组建融合基因的方法，产生融合蛋白。融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解。这种通过融合蛋白表达外源基因，特别是为相对分子质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适。
2）产生可分泌的蛋白，如外源基因表达产物可以分泌到大肠杆菌的周质或者直接分泌到培养基中。
3）外源蛋白可以在宿主细胞中以包含体的形式表达，这种不溶的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，以便于纯化。
4）选择合适的受体表达系统，如选择蛋白水解酶基因缺陷型菌株，然而这种蛋白酶基因缺陷型细胞，往往生长不正常，且不稳定。应该指出，受体细胞的选择是保证外源基因有效表达的最重要的因素之一。
