吐血推荐本人实战经验：解决ECL 半定量western blot中的高背景和非特异性带问题

我最近两个月一直在做ECL western，非常困难，都快做疯了，有几条个人经验供参考，对改善困难的非特异带和背景应该会有帮助：
1. 不要用平底小盒或杂交袋，用可以旋转的杂交管（可以用50ml塑料离心管做成），我刚刚得到了比较结果，效果大不一样。
2. 膜在blocking前先用stripping buffer处理一下（当然也在杂交管中进行，注意要通过旋转使处理均匀）。我偶然发现经过该处理后背景异常干净。并且经多次重复后得出此经验。
Stripping buffer:
100 mM 2-ME (liquid, 14.3M)
2% SDS
62.5mM Tris-HCl pH 6.7

40ml
2-ME 0.28ml
20% SDS 4ml
1M Tris-HCl pH 6.7 2.5ml
H2O   33.22ml

Protocol:

a. submerge the membrane in stripping buffer, 50-60 degree for 30 min。
b. wash the membrane for 2×10 min in TBS-T at RT
c .blocking
d. primary antibody
e. secondary antibody

3. 在托盘中封闭（可以室温几个小时或4度过夜），blocking后，用冰冷的TBST洗膜5分钟，将膜转移到杂交管中，然后加入预冷的一抗液体，4度过夜（旋转）。 之后将膜保持在冷室中，于平底托盘中用冰冷的TBST洗膜三次（在摇床上）， 然后转移到室温，再洗膜2次（注意尽量多加洗液）。然后二抗室温作用2小时（也在杂交管中），再洗膜四次就可以显色。注意洗膜时其实并没有必要摇得很厉害，缓摇就可以了，不会有影响。关键是要严格保持一抗在低温下作用，抗原抗体的结合是时间和温度的函数，在室温下一抗哪怕作用很短的时间或很低的浓度，也会带来不少背景的问题 。用杂交管的目的也是为了防止由于一抗液体一直附着于膜上而导致更强的非特异性结合。如果做到了这些细节，其实抗体的稀释度都不会是很重要的问题了。我以前找不到高背景的解决办法，把一抗稀释度调到1：3000，二抗1：5000，有一点效果，但不明显，况且信号也减弱得很厉害。可是现在一抗和二抗都用1：1000，结果很好，背景底，信号反而增强了。
4 . 此外，如果目标信号很强，可以根据信号强弱调整曝光时间来适度解决背景问题，当然如果目标信号和背景的差异不明显，这种方法是没用的。
5. 特别申明，本经验特别适用于较为困难的western blot检测，好做的根本不用这么麻烦，怎么做都有。此外待我把实验结果整理好后会把完整的过程和图片发上来。