lixingliang1987 本人最近小提质粒，挑取单克隆于3毫升LB培养基培养6小时候抽质粒，发现浓度只有50纳克每微升。后来重新挑取单克隆于10毫升LB培养基培养14小时，收集10ml菌液进行离心，裂解，上柱（10ml菌液只上一个柱子，量绝对足够了吧），结果浓度才300纳克每微升，我本计划下步做转染，如此低得浓度我很是担心啊不知道大家有没有遇到过此情况。我用的是pEGFP-N2质粒，是高拷贝的。PS：我怀疑是不 ...
淡墨留痕 我们最近在培养ＨＣＴ１１６细胞，发现其状态不是很好，很容易扎堆生长，用胰酶消化的时候也是一团一团地被消化下来，很难把它们吹散成一个一个细胞。而且长得也挺快也挺不均匀的，传代的第二天，有些地方就长得满满的了。想请教一下这是为什么呢五月鱼 你好， 我养的细胞和你一样，消化下来也是一团的，但吹打以后就没有这样的情况了。建议你分皿前还是要吹匀，分皿后在镜下看一看，移动培养皿的时候尽量动作轻，避免晃动。tianyayangg ...
doctorchihlee 大家好，请问一下空白载体（含GFP,但不含靶基因）成功转染哺乳动物细胞后，荧光显微镜下观察GFP，观察到细胞全部呈绿色还是仅仅外周发光或是核发光？谢谢！doctorchihlee GFP在细胞质，是全部发光？！？real_madrid_146 这个是我用pEGFP-C2转HEK293的图。shylook 就是这样的济南基美 全部发光，GFP由于比较小，会有部分可以进入细胞核，有文献报道过本文由丁香园论坛提供， ...
lixingliang1987 本人近日构建克隆，送公司测序。得到序列结果进行DNAMAN分析，发现和目的基因相比多出两个碱基，我随后查看测序峰图，发现峰图上并没有相应的碱基，询问过公司后，他们建议按照峰图来分析结果。像这种拼接序列和峰图序列不同的现象，不知大家平时经常遇到吗？shylook 1.峰图有的 才能有 请确认是否真的没有多出俩碱基确认后打电话给公司 两边都打开峰图 确认一下如果确实没有 即声讨不负责任 不付款 找另外的公司再测2.真 ...
程程880309 求各位：我是研一学生，因课题组的研究方向是关于microRNA，请问用哪本书比较好？谢谢各位啦~~负极兔 友情帮顶smilewei15 马上读研，现在的毕设也是这个方向~~同求~~本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming
ww_e00 我要研究Akt、PTEN蛋白在接受处理因素后的变化情况。参考一些帖子和文章，看到：5min-120min用于研究受体传递放大信号；2h-48h用于研究细胞接受信号后出现细胞周期变化、出现特定生物行为等。于是我设计了几个时间点：15min, 30min, 60min, 2h, 4h, 8h, 16h, 应该足够研究细胞接受处理后出现的短期长期变化情况了吧？fungicider 既然你查文献中是到48小时，为什么你设计的最长是到16小时？ww_ ...
drmine 假设某基因的DNA序列是：5'-GAACT-3'3'-CTTGA-5'问题一： 对 该DNA进行体外转录，得到的RNA序列是什么？问题二： 该序列对应的mRNA序列是什么？假设mRNA序列是5'-GUUCU,问题一：由该mRNA反转录得到的cDNA序列是什么？问题二： 针对该mRNA的siRNA序列，sense strand是什么？谢谢。lifz2001 1.到的RNA是5'-AGUUC3'基因组DNA在转录后经过剪切和拼接得到mRNA。 ...
bjx2325 请教，有什么比较好的办法对甲基化含量进行测定么，谢谢！shylook 1.Msp I和Hpa II联合酶切 后跑胶 根据片段长度变化 看总体甲基化变化2.CpG抗体3.甲基化敏感性高分辨熔解分析4.焦磷酸测序5.还可以用MBD珠子富集甲基化片段bjx2325 shylook wrote:1.Msp I和Hpa II联合酶切 后跑胶 根据片段长度变化 看总体甲基化变化2.CpG抗体3.甲基化敏感性高分辨熔解分析4.焦磷酸测序5.还可以用MBD珠子富集甲 ...
0534130323 请求高手：实验中细胞受刺激之后一些相关细胞因子分泌增多，我用药物处理之后这些细胞因子分泌减少了。我往上追溯其作用机制，分别检测相关调控基因的蛋白表达和mRNA表达情况。结果发现药物只影响基因的蛋白表达，对其mRNA却没有影响。请问这该如何解释？霍一刀hxs 影响翻译而不影响转录，很正常的调控方式。0534130323 非常感谢whatisever 也可能只影响蛋白的稳定性。济南基美 降解被抑制了本文由丁香 ...
freezingfall 请问战友有没有什么能常温将RNA携带的方法，求具体处理步骤，不胜感激freecell 方法1： 利用INVITROGEN的RNALATER试剂保存RNA。Room-temperature storage (18–25°C) in RNAlater is possible for up to 7 days according to manufacturer’s instructions, although significant mRNA degradation was det ...
人人都爱小勇哥 我提取植物基因组DNA ，并设计引物进行PCR反应，但是出现弥散现象，弥散部位很很亮，然后我进行胶回收，在切胶过程中切取较量部位，然后进行回收，电泳检测发现仍有弥散。不知道是怎么回事，希望各位高手给予指点，谢谢！！lifz2001 弥散原因很多，贴个图看看。体系？反应条件讲清楚？wangch84 降低引物浓度和模板投入量本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的 ...
zxsys123456 想要查阅有关模拟磷酸化方面的文献，有谁知道该怎么查？或者指点一下该怎么做突变？bigbang_0_0 突变成带负电荷的氨基酸，比如谷氨酸或天冬氨酸豆龟 zxsys123456 wrote:想要查阅有关模拟磷酸化方面的文献，有谁知道该怎么查？或者指点一下该怎么做突变？请问楼主，找到相关文献了吗？酪氨酸的磷酸化怎么模拟？本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为 ...
若水无涯 请问有谁做过3’末端切平啊？我要做平末端连接，先将目的片段通过限制酶进行酶切，可两端产生的都是3'突出末端，不知道该用那种酶进行切平比较好，看见有好多都是补平的体系，现不知道具体用哪个公司的那种酶效果会比较好，是个新手，谢谢了！sgc7901 neb不错，值得推荐。NEB 若水无涯 您好！您如果要做3‘端的切除，NEB有以下几种酶建议您可以考虑： DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment and T4 DNA Poly ...
tutufei miRNA如何构建到慢病毒载体？与基因构建到质粒载体有何区别吗？最好有具体的实验步骤，或相关资料，不胜感激！大鹏鸟 本质上没啥区别的。步骤：1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点2、化学合成3、退火形成双链4、连接到相应载体5、转化感受态，6、酶切或者PCR鉴定,测序7、扩增阳性质粒，包装慢病毒，进行细胞学实验。其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒，现在都已经商品化了，直接买来就可以用，既节约时间，又 ...
viola2010 您好，我是新手，请问核蛋白如何提取？试剂盒那个公司较好？kkndd 不用试剂盒，这篇1989年的文章的方法，我们实验室现在还在用，非常有效，非常简单，Nucleic. Acids. Res. (1989) 17: 6419. (PMID: 2771659)这是一篇比较新的文章，用的也是那篇89年的方法，Mol. Cell. Biol. (2000) 20: 8783-92. (PMID: 11073979)xhjggl 上海生工的 BSP009shylook 很多kit都可以用呀 ...
zjf0709 左侧的是提取的PUC18质粒，中间的marker不太好（可以忽略），右侧的marker是DL2000，由于跑得时间过长所以marker跑散了，右侧DL2000最上面的一个条带是2000bp，PUC18的序列是2686bp，为什么会跑的比2000bp还快？这个现象正常吗？是不是超螺旋的问题？请大家帮忙解答，谢谢！！！zjf0709 自己顶一下，请大家帮忙看一看。济南基美 是超螺旋的质粒，所以跑的快。一条带，说明都是 ...
happy0coral 哪位大侠能告诉我用pre-miR转染是属于瞬时还是稳定转染啊，另外是不是只要是转染就叫miRi啊sxj_fish 很多基因都是可以转染的 ，ＤＮＡ也可以转染，还有ＳＩＲＮＡ也是可以转染的芍药香 可以选用瞬时转染也可以选用稳定转染，不过现在microRNA的前体转染大多是瞬时的。转染只是实验方法，应用于多种核酸的转入。artneer pre-miRNA是属于瞬转，因为转染miRNA的成熟序列很多情况下效果 ...
zhangtt0530 各位，我做此连接两个月了，始终连不上，此图为连接产物跑电泳，第2道为pet32a载体单切自连，肉眼看出现两条带；第4道为载体与片段连接，在载体位置有一条带，下面还出现n条带，6道为载体单切回收，7道为载体双切回收，8道为片段双切回收。载体与片段摩尔比应该能保证在1:6-1:10之间，10μl连接体系，总DNA含量在60ng左右，用的NEB连接酶，双酶切用的takara酶，酶切回收用水洗脱，4℃连接2 ...
zhichunelan 邮件的内容如下： Please try S.Choi. I think that the PI moved to a university, although I am not 100% sure. I did EM work for them and Dr. Choi is the contact person. 请问其中PI是什么意思，课题组吗？EM work又是什么意思，是说的一部分工作吗？我以前是临床专业，现在刚刚开始涉猎分子细胞生物学方面的研究，各方面都有很多欠缺，希望大家多多帮忙。也希望有类似关于邮件翻译问题的 ...
zhangdepu_410 有做出过或者是看到过关于NF-kB激活了，但是snail却被抑制的实验么？我最近做一个实验就出现了这样的结果，查了一些文献NF-kB都是激活snail的，让我很是困惑，希望大家帮帮我！感激不尽！paroxysm 1.检测的NF-kappaB是转录水平上的激活(EMSA等等)还是磷酸化形式的上调(WB)，这里面有些不同。2.检测snail的负调控元件和抑制通路。zhangdepu_410 paroxysm ...
