【求助】miRNA如何构建到慢病毒载体
丁香园论坛
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miRNA如何构建到慢病毒载体？与基因构建到质粒载体有何区别吗？最好有具体的实验步骤，或相关资料，不胜感激！
本质上没啥区别的。
步骤：
1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
2、化学合成
3、退火形成双链
4、连接到相应载体
5、转化感受态，
6、酶切或者PCR鉴定,测序
7、扩增阳性质粒，包装慢病毒，进行细胞学实验。
其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒，现在都已经商品化了，直接买来就可以用，既节约时间，又有质量保证，何乐而不为呢？
步骤：
1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
2、化学合成
3、退火形成双链
4、连接到相应载体
5、转化感受态，
6、酶切或者PCR鉴定,测序
7、扩增阳性质粒，包装慢病毒，进行细胞学实验。
其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒，现在都已经商品化了，直接买来就可以用，既节约时间，又有质量保证，何乐而不为呢？
大鹏鸟 wrote:
本质上没啥区别的。
步骤：
1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
2、化学合成
3、退火形成双链
4、连接到相应载体
5、转化感受态，
6、酶切或者PCR鉴定,测序
7、扩增阳性质粒，包装慢病毒，进行细胞学实验。
其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒，现在都已经商品化了，直接买来就可以用，既节约时间，又有质量保证，何乐而不为呢？
2. premiRNA退火形成双链是连接到什么载体？感受态？（T载体，细菌感受态行吗 ）
3.酶切后是挂到慢病毒载体上吗？
只需要几十个碱基，不需要扩增。
有很多市场上卖的专门用于构建miRNA的，当然是细菌感受态了
是的
有很多市场上卖的专门用于构建miRNA的，当然是细菌感受态了
是的
tutufei wrote:
1.premiRNA是化学合成的吗？不是从基因组扩增？
2. premiRNA退火形成双链是连接到什么载体？感受态？（T载体，细菌感受态行吗 ）
3.酶切后是挂到慢病毒载体上吗？
1、是化学合成的。如果要做pri-miRNA可以从基因组扩增，但是你只是为了表达miRNA，没必要。
2、载体很多，比如AMBION的pSilencer 4.1，pLKo.1等等，必须是慢病毒的表达载体。感受态倒没什么限制。
3、退火后直接连慢病毒载体，不需要酶切。当然载体是需要酶切的。化学合成的时候就是直接合成酶切后的位点，而不是完全的酶切位点。
加我qq 2582634920
设计miRNA的成熟体 然后连接到慢病毒载体上 应该采用什么设计方法呢 我是菜鸟 还不是很懂这方面 请大侠指点
大鹏鸟 wrote:
本质上没啥区别的。
步骤：
1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
2、化学合成
3、退火形成双链
4、连接到相应载体
5、转化感受态，
6、酶切或者PCR鉴定,测序
7、扩增阳性质粒，包装慢病毒，进行细胞学实验。
其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒，现在都已经商品化了，直接买来就可以用，既节约时间，又有质量保证，何乐而不为呢？
多看文献
我们可以做的，需要的可以联系我，QQ:24289096
我也有问题要请教哦。
包装慢病毒的载体，我之前包装EZH2的慢病毒，用的是plvthm这个载体，是否也可以用来包装pre-miRNA的慢病毒呢?
是否需要使用有U6启动子的载体呢，为什么？
pre-miRNA用哪个网站设计哦？invitrogen行么？谢谢。
包装慢病毒的载体，我之前包装EZH2的慢病毒，用的是plvthm这个载体，是否也可以用来包装pre-miRNA的慢病毒呢?
是否需要使用有U6启动子的载体呢，为什么？
pre-miRNA用哪个网站设计哦？invitrogen行么？谢谢。
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