【求助】连接后转化什么都没长，自连对照也没有

各位，我做此连接两个月了，始终连不上，此图为连接产物跑电泳，第2道为pet32a载体单切自连，肉眼看出现两条带；第4道为载体与片段连接，在载体位置有一条带，下面还出现n条带，6道为载体单切回收，7道为载体双切回收，8道为片段双切回收。
载体与片段摩尔比应该能保证在1:6-1:10之间，10μl连接体系，总DNA含量在60ng左右，用的NEB连接酶，双酶切用的takara酶，酶切回收用水洗脱，4℃连接24小时。
酶新买的，感受态新做的，检测过了，平板也没问题。
片段300多，拿到的是直接合成并连载在pgs1克隆载体上的质粒，酶切位点BamHI、XhoI
在此图条件下，再连接转化DH5α，平板培养基上什么都没长，自连对照也没有。
垂死挣扎中。。。。。希望各位高人多多指教。。。。。。。

无外乎2个关键点：
1.载体和片段，载体在进行酶切时要切干净，做对照，单切一定要cip，不然切的好也是白搭；做连接转化时要做自连对照，看下转化子和自连的菌落数大概心里就有个概念连上没连上了；连接片段是酶切得来就可以直接连，把胶回收产物再跑个胶看看，有时候我觉得光测不是特别准，一般片段不会有特别大问题；
2.连接体系，个人觉得一次连接那么费时间，可以适当拉开比例做几个连接，然后一起进行转化
我还是建议你载体的处理要好好重视，一个好的载体是成功的一大半。

300bp对pet32，实验很好做。
1. 双酶切pET32 和 pgs1克隆载体（含目的片段），一般2h足够了。
2.电泳检测酶切效果，点样依次为：pet32，pet32双酶切，pgs1，pgs1（含目的片段）双酶切。4道！
结果大致为：pet32比pet32双酶切小，pgs1比pgs1（含目的片段）双酶切双酶切小，而且pgs1（含目的片 段）为2条带。条带过多说明可能酶切时间过长！！
3. 再次电泳（回收胶），点样：pet32双酶切，pgs1（含目的片段）双酶切。切目的片段并kit回收！
4.连接，载体和目的片段比例（1：3--1：10之间）。neb连接酶 22度 20分钟就OK！（PCR仪）
5. 转化
6. 涂板（次日观察）
7.菌落PCR筛选阳性克隆（菌落要记得保菌，可暂时放37度培养箱）
8.送保菌样品测序验证（最好自己活化菌并留备份）