在最新出版（2016.02）的冷泉港实验指南的头版，详细阐述了 CRISPR-Cas9 系统在小鼠基因编辑中应用在现代生物学中，实现对小鼠基因进行编辑或许是最重要的进步之一。然而，传统基因工程手段都很费时费力。可编程核酸酶的使用极大的提高了基因编辑技术的准确性（如，锌指核酸酶、转录激活效应核酸酶），但是这些核酸酶的设计和使用仍然纷繁复杂成本高昂。随着下一代可编程核酸酶系列--CRISPR-Cas9 系统的出现，使得基因编辑的能 ...

继玉米和水稻转基因成功之后，现已开发了高效的小麦 、大麦和燕麦转基因方法。本章对这三种作物转基因研究现状进行了叙述 ，并运用田间试验数据资料和专利文献，评述了未来转基因材料开发与利用的前景，分析了转基因作物的一些农艺性状 ，还讨论了其在生物燃料和生物制药等领域的研究拓展与机遇。

在过去 30 年中，荧光染色体分析技术促进了人们对基因组构造的了解，并加深了对 DNA 的组织结构及染色体进化的认知。通过荧光染色，即便小型染色体也可以检出，并且可以获知其组分、形态结构及进行染色体计数，可以确认物种、选系和单株的染色体非整倍性及多倍性，包括杂交或组培及遗传转化导致的染色体变异。

在过去的 25 年里，转基因植株中外源基因插入模式和位点的研究，极大地有助于人们认识植物核基因组中外源基因的整合、表达和稳定遗传的机理。同时，分子鉴定对于转基因作物的安全评估也是一个必要的步骤。因此，本章主要介绍通过根癌农杆菌介导转化，或外源 DNA 直接转化方法所获得转基因禾谷类作物和牧草中，外源基因插入模式和位点数目的标准分析流程及鉴定方法。基因组中外源基因的数目和分布情况，主要通过遗传研究、PCR 和 Southern 分析相结合的方法进行鉴定。但是，仅仅依靠这些方法，并不足以完全掌握外源基因在植物中的分布情况，如要进行精确鉴定，还需借助其他试验方法的综合分析。本章并未对这些额外方法进行详细描述，仅提供相关书籍以供读者参阅。

通过转录后水平基因沉默（PTGS) 使内源基因下调表达是鉴定植物基因功能的一把钥匙。在植物、真菌和动物界不同的物种中已经发现许多基于 RNA 水平的沉默机制，如转录后水平基因沉默、共抑制、基因压制和 RNA 干扰（RNAi ) 。其中，RNAi是最令人感兴趣的发现之一。它是一种由双链 RNA ( dsRNA) 引发的、具有序列特异性的基因沉默机制，将与目的基因序列同源的双链 RNA 导入体内，可引起该基因编码的 mRNA 降解。用改造的病毒侵染植物也能诱导 RNA 沉默，称之为病毒诱导的基因沉默（VIGS) 。与插入突变相比，这些新兴的反向遗传学方法为在大麦和小麦等谷物物种中挖掘功能基因和操控基因的表达提供了更有力的实验工具。本章介绍如何在大麦和小麦中运用 RNAi 和 VIGS 技术研究基因的功能，包括该过程涉及的分子机制及常用的材料和方法，如载体、接种过程和沉默表型分析。

利用转基因手段为主的反向遗传学实验设计时，通常要求外源基因按照预先设定的模式进行表达，而有关特定启动子的基因表达谱信息则很有限。鉴于相同的启动子-转基因构建在不同的物种中可产生不同的表达模式，预先确定待转化外源基因的表达模式就显得尤为重要。本章就禾谷类作物已鉴定的组成型、特异型或诱导型启动子进行了比较。

一、试剂准备1、Cas9 过表达慢病毒载体选择。 货号名称CR2001pLV-Cas9-PuroCR2002pLV-Cas9-NeoCR2003pLV-Cas9Nick-PuroCR2004pLV-Cas9Nick-Neo 我们现提供 4 种表达 Cas9 蛋白的慢病毒载体，您可以根据抗生素要求和基因敲除实验设计进行选择。1）抗生素选择：Puromycin 或 G418用嘌呤霉素筛选比较快，仅需 4-7 天即筛选出阳性细胞。G418 筛选需要 7-14 天左右。此外不同的 ...

分子信标的设计分子信标（Tyagi and Kramer 1996) 是另一种特异的荧光实时 PCR 探针（图 1), 这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸 杂交事件（Tyagi and Kramer 1996; Kostrikis et al. 1998; Tyagietal. 1998)。图1分子信标是一段双重标记的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一个环（探针）和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在 5'端，猝灭剂在 3'端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和 ...

导语：每年的岁末年初，《自然》杂志旗下子刊《自然·方法》（Nature Methods）都会盘点当年的年度科学技术。2015 年最受关注的技术为冷冻电镜技术（cryo-EM），此前呼声很高的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术未能折桂。在冷冻电镜的这场技术革命中，华人科学家功不可没，在某些方面甚至独领风骚，做出了诸多重大成果。文 | 张凯（剑桥大学 MRC 分子生物学实验室博士）细胞里面的生命活动井然有序，每一个部分都有其特定的结构，承担不同的功能。 ...

燕麦是一种在全球广泛种植的温带禾谷类作物，对干旱和/或高盐造成的渗透胁迫缺乏耐受能力。为了实现对现有商业化的燕麦栽培品种的遗传转化，我们建立了一套不受基因型影响的高效茎尖分生组织再生体系，4个燕麦品种 Prairie、Porter、Ogle和 Pacer 都能在体外高效地从茎尖分生组织分化出再生苗。应用这一再生体系，我们用基因枪对3个燕麦品种进行了质粒 pBY520 (带有 hva1 和 bar)和 pActl-D(带有gus)的共转化。用除草剂抗性和GUS作为标记，选择转基因阳性株系。用分子和生化的方法分析可能的转基因阳性株系，发现其中 100% 的植株带有 hva1和 bar基因，61.6%的植株同时带有三个基因（hva1、bar和进一步分析R0、R1、R2代转基因植株，显示三个基因都已稳定地整合到基因组中，其分离比符合孟德尔遗传。组织化学分析显示，在维管组织和成熟颖花的花粉粒中GUS表达水平较高。免疫化学分析显示hva1 在各个发育时期组成型表达，不过在苗早期表达水平较高。 我们分析了燕麦转基因后代 HVA1 的表达对其体内及体外渗透胁迫耐受性的影响。转基因燕麦对胁迫条件的耐受

除了为克隆基因、预测编码蛋白而需要研究基因的构成外，当前在基因组学上的努力也包括对基因组构成的研究，以分析具有结构和调控因子插入的基因。近源物种分析成为比较基因组学的主要内容，被认为是研究进化、基因功能和人类疾病的重要方法。利用该方法分析微生物，特别是细菌的基因组，早在 1996 年就已开始识别出细菌中的保守基因和与亚种相关的毒性基因（Fredricks and Reiman 1996)。这方面的进展促生了新的、大规模的检测和识 ...

这个方法适用于检测或部分 DNA 片段克隆，不适合全长基因克隆设计策略反转录 PCR 的主要问题是基因组 DNA (gDNA) 污染的存在，这将导致产生假阳性信号，特异性降低或对特定 RNA 的过高估计。为了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干扰，可将引 物设计为与两个外显子的接合部退火，该点为 cDNA 序列专有，因此 gDNA 将不能被扩增。cDNA 特异的引物可通过三个途径设计（如下图所示）。第四章 cDNA、gDNA选择性引物设计1. 引物横跨外显子-外显子接合部。设计的引物如果一半与 ...

嵌套 PCR （nested PCR,nPCR）是指以第一次 PCR 产物为模板直接进行第二次 PCR 扩增，以增加 PCR 的灵敏度，第二次 PCR 设计的引物在第一次所用引物对的内部，这种引物被称为「内部」或 「嵌套」引物。以第一次 PCR 产物为模板进行第二次 PCR 扩增，可明显提高敏感度而对特异性无损（Albert and Fenyo 1990)。由于嵌套 PCR 使用两套引物对，在补充反应组分如 Tag DNA 聚合酶后就可能提髙总循环数。如果不能进行完整的嵌套 PCR (使用两个内部引物），为提髙灵敏 ...

设计 PCR 引物时，下面这些因素你必须要知道。引物长度引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到 PCR 反应 是否成功。多数情况下，引物长度约 18~30bp, 引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。引物的解链温度PCR 反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm 值）。多数 PCR 反应最优的 解链温度应在 55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的 Tm 值取决于它的长度、序列组成和浓度 ...

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。设计策略MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一 ...

Oligo 6作为目前最好、最为专业的引物设计软件，Oligo的功能很强大，他主要功能有：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估「引物对」质量的功能，如何使用Oligo6 请参看：「两分钟教你学会 Oligo 7」Oligo 6 联合使用 Primer 5 http://wenku.baidu.com/view/da565dd380eb6294dd886c41.htmlBLAST BLAST（Basic Local Alignment Search T ...

在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于 能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。打开oligo的页面如下：单击file ...

基于细胞的酶联免疫检测实验（Cell Based Elisa）可以：（1）检测高通量的样本，定量细胞膜上或细胞内的蛋白质的表达情况。（2）用于磷酸化蛋白质的检测，易降解蛋白质的检测，少量细胞目的蛋白质的检测。试验方法原理先将细胞种于 96 孔板中，对细胞进行不同条件的处理。待检测目的蛋白时，对细胞进行多聚甲醛的固定、灭活、打孔及封闭非特异性结合位点。根据抗原抗体反应的原理，一抗孵育与目的蛋白质结合，加入酶标记二抗与一抗结合，加入底物 ...

还记得 2015 年 12 月份 CFDA 批准进行临床试验两个 1.1 类化药新药吗？ 浙江仙琚制药股份有限公司的奥美克松钠及其注射剂和北京市肿瘤防治研究所的 1.1 类血管生成抑肽及其注射剂。作为这两个新药临床前研发的参与者之一，环特生物的斑马鱼平台在其中发挥了重要作用，听我们说说其中的故事吧！奥美克松钠是由浙江仙琚制药与杭州奥默公司一起研制的治疗神经肌肉阻滞的药物，其申报适应症为在全麻手术中逆转不同浓度罗库溴铵、维库溴铵（这两种药物都是手术中常 ...

◆ 原理自然杀伤 T 细胞（NKT 细胞）被激活后会分泌大量的细胞因子，并能分化成具有细胞毒作用的效应细胞。临床研究发现 NKT 细胞参与部分疾病的调节，尤其是参与了自身免疫病，抗肿瘤 和器官移植的抗排斥反应的调节。特别是 NKT 细胞在一些自身免疫性疾病如硬皮病，I 型糖尿病及肝炎等具有免疫保护作用。目 前已知对 NKT 细胞的刺激效应最佳的物质是脑苷脂-α-半乳糖酰基鞘胺醇（α-Galactosylcermaide,α-GalCer,KRN7000），这类物质来 ...